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PCR, LA PCR & Hot Start PCR的说明

■ PCR 法的原理
PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一种体外扩增DNA的方法。通过以下三个步骤:
       DNA链的热变性 (Denaturation step)
       引物退火 (Annealing step)
       聚合酶作用下引物的延伸 (Extension step)
循环往复,可在短时间内扩增DNA达105倍以上。TaKaRa Taq 是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶,是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后,分离提取得到的,与野生型DNA polymerase具有相同的功能。
 
图1 PCR法的原理图
Step 1:在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性 (94℃、30 sec)
Step 2:引物与热变性生成的单链DNA退火 (55℃、30 sec)
Step 3:在DNA聚合酶作用下合成互补链 (72℃、1 min)
Step 4:扩增的双链DNA再次热变性生成单链DNA (返回Step 1)
Step1~4称为一个循环,如此循环往复25~30次。
注:不同的DNA片段要达到最高的扩增效率,需要设定不同的反应条件。
 
■ LA PCR
PCR法不仅仅局限于分子生物学,还因其简便、迅速等特点被广泛应用于医学、法医学、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶,但其具有如下局限性。
1. 可信度 (Fidelity)
通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高,PCR反应有时会出现错配 (Misincorporation) 现象,因而PCR克隆、变异导入等实验中,需加以注意。
2. 扩增的DNA长度
使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时,通常可扩增几kb的DNA,超过10 kb则比较困难。这就给利用PCR进行Mapping等Genome解析带来麻烦。
3. 扩增量
使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克隆及食品、环境卫生检验等时,扩增量常常达不到要求。
为解决以上难题,Takara在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上,开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术,运用此技术可大量正确地扩增长达40 kb 的DNA片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围,可在Genome解析、基因诊断、长片段 DNA的克隆及变异导入等方面发挥优势。
 
■ LA PCR的原理
LA PCR的关键是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时,反应性能将大幅度下降,TaKaRa Ex TaqTaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可将错配的碱基除去,从而延伸反应能顺利地进行下去,使长链DNA的扩增成为可能。
 
图2 LA PCR的原理图
 
■ Hot Start PCR的原理
Hot Start PCR法是提高PCR特异性的重要方法之一。这种方法可以防止在PCR反应第一步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增,从而可以提高目的DNA片段的扩增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version,TaKaRa Ex Taq Hot Start Version,TaKaRa LA Taq Hot Start Version,PrimeSTAR HS DNA polymerase,MightyAmp DNA Polymerase是抗体和DNA聚合酶的混合制品。抗体在高温加热前与聚合酶相结合,抑制聚合酶的活性。在PCR反应最初的DNA变性步骤,抗体变性,聚合酶活性恢复。
 
图3 Hot Start PCR的原理图