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Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)
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RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）
 
Code No.
包装量
价格

DRR039S
50 μl×120次
1550.00

DRR039A
50 μl×200次
2400.00

DRR039B(A×2)
50 μl×400次
4500.00

DRR039C(A×5)
50 μl×1000次
10800.00

DRR039D(A×10)
50 μl×2000次
20400.00
 
 
●制品说明  
本制品是采用探针法（TaqManTM，Molecular Beacon等）或嵌合荧光法（SYBR® Green I）进行Real Time PCR的广谱试剂。制品中已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
本制品适合于ABI PRISM®（7000，7700，7900）、LightCycler®、Smart Cycler®等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。
本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准定量曲线，对靶基因进行准确的定量、检测，重复性好，可信度高。
●制品内容(50 μl反应×200次)  
 
   
Premix Ex TaqTM（2×Conc.）* 1.0 ml ×5支
ROX Reference Dye（50×Conc.） 200 μl ×1支
       *内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+等。

●适用的Real Time PCR扩增仪    
  • ABI PRISM® 7000，7700，7900（Applied Biosystems）
  • LightCycler®（Roche Diagnostics）
  • Line-Gene（Bioer，杭州博日）
  • Smart Cycler® System（Cepheid）
  • 其他各种Real Time PCR扩增仪
  
●保存  
 
       -20℃保存。尽量避免多次反复冻融，多次反复冻融制品性能有可能下降。

●活性定义
    用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃、30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。
 
●纯 度
  1. 10 U的本酶和0.6 μg的λDNA-Hind III在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
  2. 10 U的本酶和0.6 μg的Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
  3. 10 U的本酶和0.6 μg的λDNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
●Real Time PCR性能检测
  1. 使用Smart Cycler® System Real Time PCR扩增仪，以λDNA为模板，进行300 bp DNA片段的Real Time PCR扩增，通过SYBR? Green I荧光信号的检测，确认具有良好及稳定的Real Time PCR扩增性能。
  2. 55℃条件下反应10分钟，确认抗体对Ex Taq的活性抑制效率达90%以上。
●试剂盒原理
进行PCR扩增时，在PCR反应液中加入荧光探针或荧光染料，然后在PCR扩增过程中，通过检测PCR反应液中的荧光强度，可以达到监测PCR产物扩增量的目的。
本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，并结合TaKaRa独自开发的Buffer系统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。
  1. 嵌合荧光检测法
    SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，实验时可以实时监测反应体系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
    具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

  2. TaqManTM探针法
    TaqManTM探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有荧光淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的荧光淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqManTM探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，散发出荧光。
    当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质散发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。
●试剂盒特长
  1. 适用于Real Time PCR反应，可以快速正确地对目的基因进行检测、定量。
  2. 是一种2×浓度的预混型试剂，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、荧光探针或荧光染料、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。
  3. DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。
●操作注意
  1. 冻结制品融解后请上下颠倒轻轻均匀混合，避免振荡器等剧烈搅拌。混匀制品后请用离心机轻微离心后使用。
  2. 本制品使用前请于-20℃保存，融解后的制品请于冰上放置，使用后请立即保存于-20℃。
  3. 尽量避免多次反复冻融，如果需要多次使用时，请在第一次融解后将制品按适当量分装后保存。
  4. 本制品中不含有荧光探针、荧光染料等。
  5. 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。
●Real Time PCR操作顺序
  1. 溶解试剂，上下颠倒混匀，确认溶液完全溶解。
    注）避免用振荡器混匀，剧烈振荡会降低制品性能。

    以下操作请在冰上进行，长时间室温放置会降低制品性能。
  2. 配制PCR反应用混合液，分装至PCR反应管中。
  3. 添加PCR扩增用模板。
  4. 使用Real Time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。
    注） 1. 反应液配制方法和PCR扩增条件请参照使用方法。
            2. Real Time PCR仪的使用方法，请参照各种仪器说明书。
            3. 本制品使用了抗Taq抗体，进行Hot Start法PCR扩增。
●使用方法

A）应用ABI PRISM 7000，7700，7900 Real Time PCR扩增仪的使用方法
    ※ 请按照ABI PRISM®（Applied Biosystems公司）的使用说明书要求进行实验操作。
  1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
    【使用SYBR® Green I时】


    【使用各种荧光探针时】

    *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
    *2 将SYBR® Green I原液用10 mM Tris-HCl pH 8.0或dH2O稀释至2,500～3,000倍，然后加入反应体积的1/10（V/V）量进行反应。本稀释液不宜长期保存，以现稀释现用为佳。
    *3 在25 μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
    如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
    *4 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
  2. 进行Real Time PCR反应。
    建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。



    两步法PCR扩增标准程序：
    Stage 1：预变性
    Reps：1
    95℃ 10秒

    Stage 2：PCR反应
    Reps：40
    95℃ 5秒
    60℃ 30秒（31秒*1）

    Dissociation Protocol*2

    *1使用ABI PRISM 7000时请设定在31秒以上。
    *2使用SYBR? Green I时，在PCR反应后需分析融解曲线。

  3. 实验结果分析。
    反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR® Green I时），进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

B）应用Light Cycler Real Time PCR扩增仪的使用方法
       ※ 请按照LightCycler®（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

  1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
    【使用SYBR® Green I时】


    【使用各种荧光探针时】

    *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
    *2 将SYBR? Green I原液用10 mM Tris-HCl pH 8.0或dH2O稀释至2,500～3,000倍，然后加入反应体积的1/10（V/V）量进行反应。本稀释液不宜长期保存，以现稀释现用为佳。
    *3 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
    如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
    *4 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
          
  2. 进行Real Time PCR反应。
    PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入Light Cycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。



    两步法PCR扩增标准程序：

    Stage 1：预变性
    95℃ 10秒 20℃/秒
    1 Cycle

    Stage 2：PCR反应
    95℃ 5秒 20℃/秒
    60℃ 20秒 20℃/秒
    40 Cycles

    Stage 3：融解曲线分析*
    95℃ 0秒 20℃/秒
    65℃ 15秒 20℃/秒
    95℃ 0秒 0.1℃/秒

    * 使用SYBR® Green I时进行。

  3. 实验结果分析。
    反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR® Green I时），进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

C）应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的使用方法
      ※ 请按照Smart Cycler®（Cepheid公司）的使用说明书要求进行实验操作。

  1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
    【使用SYBR® Green I时】


    【使用各种荧光探针时】


    *1～*4说明：请参见B）的同一部分的*1～*4说明。
  2. 进行Real Time PCR反应。
    PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。



    两步法PCR扩增标准程序：

    Stage 1：预变性
    Hold
    95℃ 10秒

    Stage 2：PCR反应
    Repeat：45 times
    95℃ 5秒
    60℃ 20秒

    Stage 3：Melt Curve*
    * 使用SYBR® Green I时进行。

  3. 实验结果分析。
    反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线（使用SYBR® Green I时），进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

PCR反应条件说明

【预变性】


【两步法PCR】


【三步法PCR】


*1 使用ABI PRISM系列Real Time PCR扩增仪时须设置在30秒（ABI PRISM 7000时31秒）以上。

【循环圈数】 30～45 Cycles
 
●实验例
   

Template： λDNA
Target： 检测λDNA的300 bp片段。梯度稀释制作标准曲线。
实验仪器： Smart Cycler II System
检测方法： SYBR® Green I嵌合荧光法

  1. 稀释λDNA。
    将λDNA按10的倍数稀释成0.5 fg/μl～5 ng/μl 的8个梯度浓度。
  2. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
Premix Ex TaqTM（2×）
12.5 μl
PCR Forward Primer（10 μM）
0.5 μl
PCR Reverse Primer（10 μM）
0.5 μl
SYBR® Green I稀释液*
2.5 μl
DNA模板（上述稀释液）
2.0 μl
dH2O（灭菌蒸馏水）
7.0 μl
Total
25.0 μl

* 将SYBR® Green I原液用10 mM Tris-HCl pH 8.0或dH2O稀释至2,500～3,000倍，然后加入反应体积的1/10（V/V）量进行反应。本稀释液不宜长期保存，以现稀释现用为佳。

  1. 进行Real Time PCR反应。
    用离心机轻轻离心PCR反应管后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应，进行Negative Control实验时的DNA模板使用了2 μl的灭菌蒸馏水，PCR反应条件如下：

  2. 分析Real Time PCR扩增曲线和融解曲线。



  3. 制作标准定量曲线。
    反应结束后，由各扩增曲线得到的Ct值，制作标准定量曲线。

  4. 结果说明。
    以λDNA为模板，可以检测到1 fg的λDNA。从融解曲线分析中可知，DNA的扩增产物非常单一，从标准定量曲线上可以看出，线性关系良好。因此我们可以得出结论，在实验浓度范围内，可以得到非常正确的PCR定量结果。
●进行RT-PCR反应时的实验方法

进行RT-PCR反应时，使用RT-PCR Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR043A）更为方便。RT-PCR Kit由二部分组成，即：RT Reagents（TaKaRa Code：DRR033A）和Real Time PCR Reagents（TaKaRa Code：DRR039A，即本制品）。这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：DRR043A），也可以单独购买。

  1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。
    使用TaKaRa Code：DRR033A的RT-Reagents试剂。

    *1 反转录引物可使用以下三种引物，使用量分别如下：
    Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl（50 pmol）
    Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）
    Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）
    *2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。
  2. 反转录反应条件如下：
    42℃ 10～15 min（反转录反应）
    95℃ 2 min（反转录酶的失活反应）
  3. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制）。
    （使用Smart Cycler System时）

    * 将SYBR® Green I原液用10 mM Tris-HCl pH 8.0或dH2O稀释至2,500～3,000倍，然后加入反应体积的1/10（V/V）量进行反应。本稀释液不宜长期保存，以现稀释现用为佳。
  4. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2.5～1 μl* 的RT反应液（或RT反应的稀释液），保证最终反应体积为25 μl。
    * RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。
  5. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：
  6. Real Time PCR反应结果。

    Target： Human GAPDH
    Template： Human Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液（或其稀释液），其量相当于1 pg～100 ng的Total RNA量。
                         Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。
    扩增长度： 105 bp
●引物设计说明
进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆ PCR扩增产物长度： 80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。

◆ 设计引物要求如下：


*1 OLIGO: Primer Analysis Software。
*2 Primer3: （http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/）
*3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
●特别提示：本公司提供免费引物设计服务
对美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat的RefSeq（Human 18,000种，Mouse 15,000种，Rat 4,300种），本公司可以免费帮助设计Real Time PCR或RT-PCR用引物（仅限于使用SYBR Green I的Real Time PCR体系）。具体情况如下：

可提供3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
2. 从5’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
3. 针对Target基因全长的引物候补序列。
●问答
Q1 Premix Ex Taq融解时，见到有絮状沉淀物，怎么办？
A1 融解不彻底时，有时会有白色或淡黄色絮状沉淀物。此时请用手稍微加热或于室温稍微放置制品，然后进行上下颠倒混合，使制品充分溶解。溶解后的制品性能不会受到影响，但请不要用振荡器等剧烈搅拌混合。
   
Q2 反复冻融对Premix Ex Taq影响如何？
A2 经本公司实验确认，反复冻融10次不会影响制品性能。
   
Q3 Premix Taq Ex Taq可不可以于4℃保存？
A3 经本公司实验确认，4℃保存一个月不会影响制品性能。但为了保证制品长期性能稳定，本公司推荐以-20℃保存为佳。
   
Q4 使用Premix Ex Taq时，是否要对Mg2+浓度进行研讨？
A4 使用Premix Ex Taq时，不需要对Mg2+浓度进行研讨。实验时首先请使用本公司说明书推荐的PCR反应条件，如果得不到良好实验结果时请研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。
   
Q5 Premix Ex Taq的PCR扩增对使用引物有何要求？
A5 PCR用制品的DNA扩增性能与引物种类有一定的内在关系，本公司提拱SYBR Green I嵌合荧光法的PCR或RT-PCR用引物的免费设计服务，详细情况请参见「引物设计说明」部分。使用TaKaRa设计推荐的引物，将更适合于Premix Ex Taq的Real Time PCR扩增。
   
Q6 使用ABI PRISM仪器时，是否需要进行了95℃ 10分钟的变性步骤？
A6 本制品不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照本公司说明书的实验条件要求进行PCR反应。
   
Q7 使用ABI PRISM仪器时实验结果不好，融解曲线无主峰，为什么？
A7 Premix Ex Taq中不含有ROX Reference Dye，在制品包装中另外附有。进行Real Time PCR反应时需在反应体系中添加ROX Reference Dye，在反应体系中不添加ROX Reference Dye时，融解曲线图将会产生无主峰的一条紊乱的波浪线。