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SYBR®Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)
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Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)
★ SYBR® RT-PCR Kit（Perfect Real Time）
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RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
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SYBR® RT-PCR Kit（Perfect Real Time）
 
Code No.
包装量
价格

DRR045S
50 μl×120次
2950.00

DRR045A
50 μl×200次
3800.00
 
 
●制品说明  
本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time RT-PCR的专用试剂。Real Time PCR方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本制品可以准确简便地进行mRNA的表达分析。
本制品由「A. 反转录反应试剂」（TaKaRa Code：DRR033A）和「B. PCR反应试剂」（TaKaRa Code：DRR041A）两部分构成。其「B. PCR反应试剂」部分已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP、SYBR® Green I等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。
「B. PCR反应试剂」制品中的PCR用DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，并与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。
本制品适合于ABI PRISM®（7000，7700，7900）、LightCycler®、Smart Cycler®等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。
本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准定量曲线，对靶基因进行准确的定量、检测，重复性好，可信度高。
●制品内容(50 μl反应×200次)  
 
本制品由二部分构成，即「A. 反转录反应试剂」（TaKaRa Code：DRR033A）及「B. PCR反应试剂」（TaKaRa Code：DRR041A）。「A. 反转录反应试剂」和「B. PCR反应试剂」可以成套订购（TaKaRa Code：DRR045A），也可以分别购买。A及B部分制品的具体组份分别如下：
A. 反转录反应试剂（10 μl反应×200次，TaKaRa Code：DRR033A）

5×M-MLV Buffer

 400 μl
dNTP Mixture（各10 mM） 100 μl
Oligo dT Primer（50 μM） 100 μl
Random 6 mers（100 μM） 100 μl
M-MLV RTase（RNase H free, 200 U/μl） 50 μl
RNase Inhibitor（40 U/μl） 50 μl
RNase Free dH2O 1100 μl

B. PCR反应试剂（50 μl反应×200次，TaKaRa Code：DRR041A）

SYBR® Premix Ex TaqTM（2×Conc.）*

 1.0 ml ×5支
ROX Reference Dye（50×Conc.） 200 μl ×1支
*内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+,SYBR® Green I等。
 

●适用的Real Time PCR扩增仪    
  • ABI PRISM® 7000，7700，7900（Applied Biosystems）
  • LightCycler®（Roche Diagnostics）
  • Line-Gene（Bioer，杭州博日）
  • Smart Cycler® System（Cepheid）
  • 其他各种Real Time PCR扩增仪
  
●保存  
 
      -20℃保存。「B. PCR反应试剂」请于-20℃避光保存，同时请避免多次反复冻融。
●试剂盒原理  
 

本制品首先利用反转录酶M-MLV RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用TaKaRa Ex Taq HS进行Real Time PCR扩增反应（使用SYBR® Green I嵌合荧光法）。
RT-PCR反应采用了如图1显示的2 Step RT-PCR方法。反转录反应以Total RNA为模板，以Random 6 mers或Oligo dT Primer为反转录引物时，可以进行多基因的表达分析；如只扩增一种目的基因，也可以使用Specific Primer（Reverse）为反转录引物，合成cDNA。然后以合成的cDNA为模板，以Specific Primer（Forward，Reverse）为引物，进行Real Time PCR扩增反应。
Real Time PCR扩增反应采用了如图2显示的SYBR® Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR® Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。


● 嵌合荧光检测法
SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，实验时可以实时监测反应体系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。
具体原理见图2。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

●试剂盒特长
  1. 通过Real Time RT-PCR反应，可以快速、准确地对mRNA进行表达分析。
  2. 采用2 Step RT-PCR法，反转录反应时如果使用Random 6 mers或Oligo dT Primer，能够获得多种基因的cDNA，可灵活使用于各种不同实验。
  3. PCR用DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。PCR反应试剂是预先混有SYBR® Green I的2×浓度的Premix Type试剂，PCR反应液配制十分简单方便。
●RNA样品制备
本试剂盒是将RNA合成cDNA，然后再对此cDNA进行扩增的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
（1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
（2） 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】
用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 min.）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。
RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】
使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。
 
●操作注意

以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。

  1. 当同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、各种酶等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
  2. 使用Reverse Transcriptase和RNase Inhibitor时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
  3. SYBR® Premix Ex TaqTM融解后，请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。
  4. 本制品使用前请于-20℃保存，融解后的制品请于冰上放置，使用后也请立即保存于-20℃。
    SYBR® Premix Ex TaqTM应尽量避免多次反复冻融，如果需要多次使用时，请在第一次融解后将制品按适当量分装后保存。
  5. 保存SYBR® Premix Ex TaqTM试剂或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  6. 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。
●操作方法

一、反转录反应
    1. 按下列组份配制RT反应液（反应液配制请在冰上进行）。

      注）进行多份RT反应时，请预先配制多份反应液的各种试剂混合液（Master Mix），然后再分装至反应管中，这样可使实验更加准确可靠，方便实验操作，减少试剂污染。

      *1 反转录引物可根据引物的设计位置（与mRNA 3’端的距离）、扩增的目的基因数目等选择以下三种引物，使用量分别如下：
      Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl（50 pmol）
      Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）
      Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）
      *2 反应体系可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

    2. 反转录反应条件如下。
      42℃ 10～15 min（反转录反应）
      95℃ 2 min（反转录酶的失活反应）

二、Real Time PCR反应

A）应用ABI PRISM 7000，7700，7900 Real Time PCR扩增仪的操作方法
※ 请按照ABI PRISM®（Applied Biosystems公司）的使用说明书要求进行实验操作。

    1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

      *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
      *2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。
    2. 进行Real Time PCR反应。
      建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。


      两步法PCR扩增标准程序：
      Stage 1：预变性
      Reps：1
      95℃ 10秒

      Stage 2：PCR反应
      Reps：40
      95℃ 5秒
      60℃ 30秒（31秒*1）

      Dissociation Protocol

      *1使用ABI PRISM 7000时请设定在31秒以上。

    3. 实验结果分析。
      反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

B）应用Light Cycler Real Time PCR扩增仪的操作方法
※ 请按照LightCycler®（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。

    1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

      *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
      *2 建议使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。
    2. 进行Real Time PCR反应。
      PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入Light Cycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

      两步法PCR扩增标准程序：

      Stage 1：预变性
      95℃ 10秒 20℃/秒
      1 Cycle

      Stage 2：PCR反应
      95℃ 5秒 20℃/秒
      60℃ 20秒 20℃/秒
      40 Cycles

      Stage 3：融解曲线分析
      95℃ 0秒 20℃/秒
      65℃ 15秒 20℃/秒
      95℃ 0秒 0.1℃/秒

    3. 实验结果分析。
      反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

C) 应用Smart Cycler II System Real Time PCR扩增仪的操作方法
※ 请按照Smart Cycler®（Cepheid公司）的使用说明书要求进行实验操作。

    1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

      *1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内调整引物浓度。
      *2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。
    2. 进行Real Time PCR反应。
      PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件说明」。

      两步法PCR扩增标准程序：

      Stage 1：预变性
      Hold
      95℃ 10秒

      Stage 2：PCR反应
      Repeat：45 times
      95℃ 5秒
      60℃ 20秒

      Stage 3：Melt Curve

    3. 实验结果分析。
      反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准定量曲线等。

PCR反应条件说明

【预变性】


【两步法PCR】


【三步法PCR】


*1 使用ABI PRISM系列Real Time PCR扩增仪时须设置在30秒（ABI PRISM 7000时31秒）以上。

【循环圈数】 30～45 Cycles
 
●实验例
   

本实验以Mouse Liver Total RNA为模板，使用2 Step Real Time RT-PCR方法，扩增Mouse GAPDH基因。实验时，首先以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA溶液10倍梯度稀释，再将相当于1 pg～100 ng Total RNA量的cDNA作为模板，进行Real Time PCR扩增，制作标准定量曲线。具体实验过程如下：

◆反转录反应。
使用本制品的「A. 反转录反应试剂」（TaKaRa Code：DRR033A）。以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应。

  1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制）。

    *1 反转录引物可使用以下三种引物，使用量分别如下：
    Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl（50 pmol）
    Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl（25 pmol）
    Specific Primer（2 μM） 0.5 μl（1 pmol）
    *2 反应体积可按需求相应放大，10 μl的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。
  2. 反转录反应条件如下：
    42℃ 10 min（反转录反应）
    95℃ 2 min（反转录酶的失活反应）

◆Real Time PCR反应。
使用本制品的「B. PCR反应试剂」（TaKaRa Code：DRR041A）。

Target： Mouse GAPDH
Template： Human Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液。
将cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀释（10倍梯度稀释）后，各取2 μl进行Real Time PCR反应。此时25 μl PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于从100 ng，10 ng，1 ng，100 pg，10 pg，1 pg的Total RNA反转录得到的cDNA量。
Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。
扩增长度： 105 bp
使用仪器： Smart Cycler System

  1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制）。

  2. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 μl* 的上述各cDNA的梯度稀释液。
    * RT反应原液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。
  3. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

  4. Real Time PCR反应结果。
    Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

    反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准定量曲线。

  5. 结果分析。
    本实验检测到了Mouse Live Total RNA 1 pg～100 ng相当量的cDNA。分析融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时定量曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。


●引物设计说明
进行Real Time PCR反应时，设计反应性能良好的PCR引物非常重要。根据以下原则，可以设计PCR扩增效率高，反应特异性强的良好引物。

◆ PCR扩增产物长度： 80～150 bp最佳（可以延长至300 bp）。

◆ 设计引物要求如下：


*1 OLIGO: Primer Analysis Software。
*2 Primer3: （http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/）
*3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
●特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务

本公司以美国NCBI Data Base上登录的Human、Mouse、Rat的RefSeq（Human 18,000种，Mouse 15,000种，Rat 4,300种）为对象，已经设计完成了各基因用于定量表达分析的Real Time RT-PCR用高特异性Primer Set，此Primer Set最适于本制品使用，可省略PCR反应条件优化实验。（仅限于使用SYBR Green I的Real Time PCR体系）。具体情况如下：

可提供3对合适的引物，由客户自己选择。

1. 从3’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
2. 从5’端开始的1,500 Base内的引物候补序列。
3. 针对Target基因全长的引物候补序列。
●问答
Q1 SYBR Premix Ex Taq融解时，见到有絮状沉淀物，怎么办？
A1 融解不彻底时，有时会有白色或淡黄色絮状沉淀物。此时请用手稍微加热或于室温避光稍微放置制品，然后进行上下颠倒混合，使制品充分溶解。溶解后的制品性能不会受到影响，但请不要用振荡器等剧烈搅拌混合。
   
Q2 反复冻融对SYBR Premix Ex Taq影响如何？
A2 经本公司实验确认，反复冻融10次不会影响制品性能。
   
Q3 SYBR Premix Ex Taq可不可以于4℃保存？
A3 经本公司实验确认，4℃保存一个月不会影响制品性能。但为了保证制品长期性能稳定，本公司推荐以-20℃保存为佳。
   
Q4 使用SYBR Premix Ex Taq时，是否要对Mg2+浓度进行研讨？
A4 使用SYBR Premix Ex Taq时，不需要对Mg2+浓度进行研讨。实验时首先请使用本公司说明书推荐的PCR反应条件，如果得不到良好实验结果时请研讨PCR反应条件，改变使用的PCR引物等。
   
Q5 SYBR Premix Ex Taq的PCR扩增对使用引物有何要求？
A5 PCR用制品的DNA扩增性能与引物种类有一定的内在关系，本公司提拱SYBR Green I嵌合荧光法的PCR或RT-PCR用引物的免费设计服务，详细情况请参见本说明书的「引物设计说明」部分。使用TaKaRa设计推荐的引物，将更适合于SYBR Premix Ex Taq的Real Time PCR扩增。
   
Q6 使用ABI PRISM仪器进行Real Time PCR反应时，是否需要进行了95℃ 10分钟的变性步骤？
A6 本制品不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照本公司说明书的实验条件要求进行PCR反应。
   
Q7 使用ABI PRISM仪器进行Real Time PCR反应时实验结果不好，融解曲线无主峰，为什么？
A7 SYBR Premix Ex Taq中不含有ROX Reference Dye，在制品包装中另外附有。进行Real Time PCR反应时需在反应体系中添加ROX Reference Dye，在反应体系中不添加ROX Reference Dye时，融解曲线图将会产生无主峰的一条紊乱的波浪线。
   
Q8 和某些公司制品相比，SYBR Premix Ex Taq制品的颜色较淡，为什么？
A8 有些公司的Premix制品中已经加有ROX Reference Dye，所以颜色较深。而SYBR Premix Ex Taq在制品中没有添加ROX Reference Dye，但在制品包装中另外附有，所以SYBR Premix Ex Taq颜色较淡。