b-Agarase

DF8006

100 U

268 元

制品说明

b-Agarase可以切断琼脂糖【α-L（1，4）-3，6-半乳糖酐-β-D（1，3）半乳糖多聚体】生成琼脂寡糖。本制品是一种耐高温的琼脂糖酶，反应最适温度为60℃，适合于高温 (60℃) 下的琼脂糖降解反应。本制品适用于DNA片段的切胶回收，将含有DNA片段的琼脂糖凝胶切下后，在再熔解温度下再熔化琼脂糖胶，然后使用本制品降解琼脂糖，再经乙醇沉淀回收目的DNA片段。本制品特别适合于数十kbp以上的长片段DNA的切胶回收，且对DNA片段不产生损伤。

活性定义

1个活性单位的定义为：在60℃反应1小时的条件下，降解1%（W/V）浓度的200 ml熔解后的低熔点琼脂糖生成可溶性琼脂寡糖所需的酶量。

纯度

● 8 U的本酶和1 mg的l-Hind III片段在60℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

● 8 U的本酶和1 mg的Supercoiled pBR322 DNA在60℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不

发生变化。

● 2 U的本酶和1 mg的16S，23S rRNA在37℃下反应3小时，RNA的电泳谱带不发生变化。

● 1 U、5 U的本酶分别与1 mg的l-Hind III 片段和1 mg的l-Pst I 片段在37℃或60℃下反应

1小时后，再进行连接再切断实验，确认100% DNA片段能够连接，100%能被再切断，未检测出有3'、5'核酸外切酶活性及磷酸酶活性。

用途

b-Agarase可以应用于DNA片段的琼脂糖凝胶回收实验。本制品降解琼脂糖后形成不能再成胶的碳水化合物分子，同时释放DNA片段。这些降解后产生的碳水化合物分子或b-Agarase通常不会影响限制酶酶切反应，DNA的连接转化等。b-Agarase特别适用于从凝胶中纯化大片段（>50 kb）DNA，同时也可以用于小片段DNA的纯化。

Protocol

1. 进行琼脂糖凝胶电泳（使用低熔点琼脂糖效果更佳)。

2. 将含有目的DNA片段的凝胶切出，切成细块后移入已称重的Microtube中确认凝胶重量。

3. 加入1/10凝胶体积*的10×b-Agarase Buffer平衡体系。

* 按凝胶重量1 mg=1 ml进行计算。

4.琼脂糖再熔化（具体再熔胶条件请参考各琼脂糖制品说明书，例如：LM-SIEVE Agarose

的再熔胶条件为65℃，10分钟)，冷却至60℃后静置平衡5分钟。

5. 加入b－琼脂糖酶消化反应1小时，每200 mg（约200 ml）的1%凝胶中加入2 U的b-

Agarase。

6. 冰中放置15分钟后，12,000 g离心15分钟。

7. 取出上清液（含DNA)，加入盐溶液（盐终浓度：2.0 M CH3COONH4；0.15 M NaCl；

0.3 M CH3COONa或0.8 M LiCl)。

8. 加入1倍体积的异丙醇，充分混匀后-20℃冷却60分钟（或-80℃ 20分钟)。

9. 12,000 g离心15分钟。

10. 除去上清，用70%的冷异丙醇清洗沉淀两次，真空干燥。

11. 用TE Buffer或其他合适的缓冲液溶解DNA沉淀。

从琼脂糖凝胶中回收DNA片段