One Step SYBR(R) RT-PCR Kit

(Perfect Real Time)

DRR046A

50 ml反应×100 次

3,000 元

制品说明

本制品是采用SYBR(R) Green I 嵌合荧光法进行Real Time One Step RT-PCR反应的专用试剂。Real Time PCR方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本制品进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。

本制品适合于ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler(R) 、Line-Gene、Smart Cycler(R)、Mx3000P等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

适用的Real Time PCR扩增仪

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems）

LightCycler(R)（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

Smart Cycler(R) System（Cepheid）

Mx3000P (Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪

试剂盒原理

本制品首先利用反转录酶M-MLV RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用TaKaRa Ex Taq HS在同一反应管内连续进行Real Time PCR扩增反应（使用SYBR(R) Green I 嵌合荧光法)。

RT-PCR反应采用了如图1显示的One Step RT-PCR方法。反转录反应以Total RNA为模板， 以Specific Primer（Reverse）为反转录引物（本制品不能使用Random Primer和Oligo dT Primer进行反转录反应）合成cDNA。然后以合成的cDNA为模板，以Specific Primer (Forward，Reverse）为引物，进行Real Time PCR扩增反应。

Real Time PCR扩增反应采用了如图2显示的SYBR(R) Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR(R) Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。

图1 One Step RT-PCR法原理图

图2 嵌合荧光法原理图

特长

● 通过Real Time One Step RT-PCR反应，可以快速、准确地对RNA病毒等微量RNA进

行分析。

● PCR用DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，

再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。2×浓度的RT-PCR Buffer中预先混有SYBR(R) Green I 等，反应液配制十分简单方便。

Application

Rat Atp5f1基因的检测（使用Smart Cycler II System）

本实验以Rat Liver 10 pg～100 ng的Total RNA为模板，使用Real Time One Step RT-PCR方法，扩增Rat Atp5f1基因。

1. 按下列组份配制Real Time One Step RT-PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

实验例

2. Real Time One Step RT-PCR的反应条件如下：

3. Real Time One Step RT-PCR的反应结果。

Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

4. 结果分析。

本实验检测到了Rat Liver 10 pg～100 ng Total RNA中的目的基因。分析融解曲线可知， 无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好， 在实验浓度范围内能够进行准确定量。