One Step RT-PCR Kit

(Perfect Real Time)

DRR044A

50 ml反应×100 次

2,900 元

制品说明

本制品是采用探针法（TaqManTM，Molecular Beacon等）或嵌合荧光法（SYBR(R) Green I）进行Real Time One Step RT-PCR的广谱试剂。Real Time PCR方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本制品进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。本反应体系由于可以对扩增产物进行实时检测，大大提高了检测灵敏度，并省略了PCR反应后的电泳步骤，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。

本制品适合于ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler(R) 、Line-Gene、Smart Cycler(R)、Mx3000P等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

适用的Real Time PCR扩增仪

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems）

LightCycler(R)（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

Smart Cycler(R) System（Cepheid）

Mx3000P (Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪

试剂盒原理

本制品首先利用反转录酶M-MLV RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用TaKaRa Ex Taq HS在同一反应管内连续进行Real Time PCR扩增反应（使用TaqManTM探针法或SYBR(R) Green I 嵌合荧光法)。

RT-PCR反应采用了如图1显示的One Step RT-PCR方法。反转录反应以Total RNA为模板， 以Specific Primer（Reverse）为反转录引物（本制品不能使用Random Primer和Oligo dT Primer进行反转录反应）合成cDNA。然后以合成的cDNA为模板，以Specific Primer(Forward，Reverse）为引物，进行Real Time PCR扩增反应。

Real Time PCR扩增反应可采用如图2显示的SYBR(R) Green I 嵌合荧光法或如图3显示的TaqManTM探针法等。

● One Step RT-PCR法

图1 One Step RT-PCR法原理图

● 嵌合荧光检测法

SYBR(R) Green I与双链DNA结合后发出荧光，实验时可以实时监测反应体系中的SYBR(R) Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见图2。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR(R) Green I与双链DNA结合发出荧光， 通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

图2 嵌合荧光法原理图

● TaqManTM探针法

TaqManTM探针法是使用5'端带有荧光物质（如：FAM等)，3'端带有荧光淬灭物质（如:TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5'端的荧光物质受到3'端的荧光淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqManTM探针被分解后，5'端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5'→3'Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度， 可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见图3。

图3 TaqManTM探针法原理图

特长

● 通过Real Time One Step RT-PCR反应，可以快速、准确地对RNA病毒等微量RNA进

行分析。

● PCR用DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，

再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。2×浓度的RT-PCR Buffer中预先混有dNTP、Mg2+等，反应液配制十分简单方便。

Application

Rat Atp5f1基因的检测（使用Smart Cycler II System）

本实验以Rat Liver 10 pg～100 ng的Total RNA为模板，使用Real Time One Step RT-PCR方法，扩增Rat Atp5f1基因（检测方法采用了SYBR(R) Green I 嵌合荧光法）

1. 按下列组份配制Real Time One Step RT-PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

实验例

* 将SYBR(R) Green I原液 (10,000×) 用10 mM Tris-HCl pH 8.0或dH2O稀释2,500～3,000倍，然后

加入反应体积的1/10（V/V）量进行反应。本稀释液不宜长期保存，以现稀释现用为佳。

2. Real Time One Step RT-PCR的反应条件如下：

3. Real Time One Step RT-PCR的反应结果。

Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

4. 结果分析。

本实验检测到了Rat Liver 10 pg～100 ng Total RNA中的目的基因。分析融解曲线可知， 无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好， 在实验浓度范围内能够进行准确定量。

Perfect Real Time系

列产品问答

TaKaRa「Perfect Real Time」制品应如何保存?

经实验确认，SYBR(R) Ex TaqTM (perfect Real Time) (Code No.DRR041)制品4℃保存一年性能稳定，而多次反复冻融性能有可能下降，所以本公司推荐此制品4℃避光保存，避免冻结。除此之外的其他「Perfect Real Time」制品为了保持制品长期性能稳定，建议-20℃保存。

TaKaRa「Perfect Real Time」系列产品使用了Hot Start DNA聚合酶，反应前是否需要进行酶的活性化步骤?

本系列产品使用的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq(R) HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化步骤。高温处理时间过长，会使酶的活性下降， 其PCR的扩增效率、定量精确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、10秒。进行RT-PCR反应时，RT反应后，PCR反应前的反转录酶的热变性失活，通常设定为95℃、2分钟。

进行二步法Real Time RT-PCR反应时，RT反应后，以cDNA（RT反应液）为模板加入到PCR反应体系中的量是多少?

应用二步法RT-PCR进行Real Time RT-PCR反应时，可选择ExScriptTM RT-PCR Kit「Perfect Real Time」(TaKaRa Code DRR051A）或SYBR(R) ExScriptTM RT-PCR Kit「Perfect Real Time」(TaKaRa Code DRR053A）两种制品。RT反应后，RT反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。例如：25 ml PCR反应体系中加入的RT反应液为1～ 2.5 ml。

使用TaKaRa「Perfect Real Time」系列产品，是否需要对Mg2+浓度进行研讨?

不需要对Mg2+浓度进行研讨。如果使用本公司设计合成的引物或遵循各产品说明书中介绍的引物设计原则设计的引物，按照说明书推荐的反应条件进行反应，通常都会得到良好的实验结果。如果得不到良好实验结果，请研讨PCR反应条件，或更换PCR引物等。

通常PCR反应按三步法进行，为何使用TaKaRa「Perfect Real Time」系列产品时推荐的PCR程序为两步法?

本公司「Perfect Real Time」系列产品的大量实验数据表明，两步法PCR可以缩短反应时间，增强反应特异性，提高扩增效率，可以得到良好的实验结果，所以我们推荐设定的标准程序为两步法PCR。退火/延伸温度为60℃，条件优化时可在60-66℃范围内研讨。

避免退火/延伸温度设定为68℃，温度过高引物退火不完全，扩增效率下降。如果两步法PCR反应性能较差时，可变更为三步法PCR程序。

使用TaKaRa「Perfect Real Time」系列产品对引物有何要求?

进行扩增效率良好的「Perfect Real Time」PCR反应，设计反应性能优越的引物非常重要。有时无论怎样进行条件研讨，都得不到良好的结果，此时建议重新设计引物。

我们在各产品说明书中详细介绍了引物设计原则，请参考使用。同时，本公司还开设了Real Time PCR用引物设计合成服务，详细内容请参照本商品目录F32～F34页。 如果利用本公司设计合成的引物，按照说明书中推荐的标准两步法PCR程序，通常都会得到良好的实验结果，欢迎惠顾本公司 Real Time PCR用引物设计合成服务。

TaKaRa「Perfect Real Time」系列产品中附带的ROX Reference Dye和ROX Reference Dye II如何使用?

这两种染料只使用在Applied Biosystems、stratgene等公司的Real Time PCR装置上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，反应时请按1/50量添加。

ABI 7500, 7500 Fast Real Time PCR System、stratgene Mx 3000 P请使用ROX Reference Dye II ，其它机型ABI PRISM(R) 7000/7700/7900 HT和7300 Real Time PCR System请使用ROX Reference Dye。 LightCycler(R)、Smart Cycler(R) System、Line-Gene等Real Time PCR装置不必使用这两种校正用染料。