美国454 Life Sciences公司开发了新一代高速测序系统，该测序系统一经推出，便表现出强大的生命力。

TaKaRa公司利用该系统，开始承接高速的测序服务。一次解析可获得20 Mb以上的序列信息，是一种全新的高速测序方法。

利用454测序系统，一次解析便可获得20 Mb以上的序列信息，只需花费一周左右的时间。例如：要对约为2 Mb的乳酸菌基因组进行解析时，与Sanger法相比，所需时间只要后者的1/3以下，而价格则不足后者的一半。

利用454测序系统，除了可以进行基因组解析，我们还开发了其它应用领域，我们有理由相信，454测序方法正在成为大规模高速测序的主流方法！

454系统的解析方法说明

通常需要提供10 mg以上的DNA，质量检测合格后，按以下流程进行解析。

1. 构建DNA Library。

DNA经物理方法处理成500 bp左右的片段，两端与接头（Adaptor）相连接。

2. 乳滴PCR（Emulsion PCR）反应。

与Adaptor相连的DNA片段和固定有与Adaptor序列互补序列的Beads混合后，进行Emulsion PCR。由于一个DNA片段分子和一个Beads被分配在一个乳滴中，PCR反应后，该DNA的扩增片段便被固定到同一乳滴中的Beads上。将该Beads填充到特殊反应器（PicoTiterPlateTM）的各孔中（每个孔中只有一个Beads)，如此可同时填充数十万个。

Before PCR

After PCR

Deposit Beads into the well of

PicoTiterPlateTM

Emulsion PCR

3. Pyrosequence反应。

以Beads表面固定的DNA为模板，分别加入A、C、G、T反应液依次进行反应，一个碱基一个碱基地延伸，循环往复多次。由于每次延伸都会产生焦磷酸，而焦磷酸与反应底物作用产生的光信号可以被测序系统检测。每个反应孔可以得到100 base对应的信号（Basecall)。

解析服务应用范围

1. 微生物基因组解析。

预定的解析量一般是预想基因组大小的15倍以上。提供的解析结果是经过处理（Assemble）的Contig序列信息。由于样品DNA没有经过克隆等处理步骤，所以不存在由于克隆产生的取舍偏差（Cloning bias)，减少了序列中缺口（Gap）数量。如果要得到精度更高的序列信息，可以和Sanger法配合进行解析。如果要对测得基因进行注释（Annotation）或与近缘物种基因组序列进行比对，可以利用TaKaRa公司的基因组比对解析服务。本服务和Sanger法相结合可以得到更高精度的解析结果，服务期限、价格等方面和原来相比也有明显优势。

2. small RNA网罗解析。

分离的small RNA经克隆后用于small RNA的网罗解析。一次同时可以进行多个样品的small RNA解析。

得到的测序结果可以与Genome进行比对（Mapping）或与miRBase中的miRNA进行同源分析等。同时还可以对测得的结果进行聚类分析（Clustering）或通过二级结构预测寻找新的候补miRNA等工作。

3. 其它方面的应用。

● 转录产物（EST）的网罗解析。

● SNP或突变频率解析。

● ChIP样品的网罗解析。

● 多源基因组（Metagenome）解析。

● 超微量样品的解析。