pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶双酶切效果

在基因工程实验中，经常要对DNA片断进行多种限制酶的酶切反应。但经过实验验证，对在DNA片段上相邻或相近的两个限制酶切位点进行双酶切反应时，往往达不到预期的效果。例如，对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的Kpn I 和Sma I 进行双酶切时，酶切反应难以进行。而针对有些酶切位点进行双酶切时，酶切效果与酶切反应所用限制酶的顺序还有关系。例如，要对Sac I 和Kpn I 这两个酶切位点进行双酶切时，如果先用

Sac I 进行酶切，然后再用Kpn I 进行酶切，双酶切反应则无法进行。但是如果先用Kpn I 进行酶切，然后再用Sac I 进行酶切，双酶切反应则可以进行。造成这些结果的原因是因为进行限制酶的双酶切反应时，由于受到酶切位点周围碱基数量的影响，从而影响了酶切效果。

本公司对pUC18/19/118/119载体多克隆位点处的限制酶进行双酶切时的效果，进行了实验验证，结果见表1和表2。表1是用两种限制酶进行分步酶切时的结果，表2是用两种限制酶进行同步酶切时的结果。

为了保证实验的顺利进行，对载体多克隆位点上的限制酶进行双酶切时，应该考虑各限制酶之间的位置关系。

下表中记号：“O”表示限制酶酶切效果较好;“△”表示限制酶的酶切效果不太好;“X”表示限制酶酶切效果很差。

表1 分步酶切效果

表2 同步酶切效果

注：1. 对相邻酶切位点的限制酶进行双酶切反应时，同时加入限制酶进行双酶切反应的切断效果都不太理想，建议按先后顺序加入相应的限制酶进行酶切反应。

2. 使用EcoR I进行酶切反应时，酶切体系为20 �ml，将酶的添加量控制在10 U左右，反应时间控制在2小时左右，双酶切效果较好。