Competent Cell Preparation Kit

D406

200 次量

180 元

制品说明

大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA (Plasmid DNA、Phage DNA等），处于这种状态的细胞称为感受态细胞 (Competent Cell)。在基因工程实验中，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。

实验使用的感受态细胞的来源大体可以分为两种：一种是购买商品化的感受态细胞，但商品化感受态细胞成本高、运输及保存有一定困难（超低温)；另一种是自己制备感受态细胞，实验人员自己制作感受态细胞时，往往受到各种试剂及实验条件等限制，制备的感受态细胞效率低，达不到实验要求。

TaKaRa Competent Cell Preparation Kit是一种方便、高效、快速制备感受态细胞的试剂盒。使用本试剂盒制备的感受态细胞可以满足大多数实验的需要，并且适用于几乎所有常用的大肠杆菌，例如：E.coli DH5a、JM109、CJ236、HB101、MV1184、BMH71-18mutS等，转化效率均可以达到1×106 cfu/mg pUC19以上（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。使用本试剂盒制备的感受态细胞可以在-80℃保存一年。

注意事项

1. 制作感受态细胞时应使用专用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷这些玻璃器皿或塑料容器时

应尽量洗净。由于微量的洗涤剂或污染物都可能降低感受态细胞的转化效率，因此在洗刷完用于制作感受态细胞的专用玻璃器皿或塑料容器后,最好用去离子水浸泡一晚，然后再充分洗净。

2. 制作感受态细胞时使用的菌种，不应使用4℃或常温保存的传代细菌。应使用-70℃保存

的菌种，在LB/抗生素平板培养基上分级划线培养后，挑取单菌落。使用这种菌种制作的感受态细胞，能提高转化效率。

3. 培养感受态细胞制备用菌体时，OD600值的测定应随时进行,以使OD600值控制在0.35~

0.5之间。如果OD600值超出此范围，可能降低感受态细胞的转化效率。

4. 用于感受态细胞制备的菌体培养停止后要立即处理，不要将培养液过长时间室温放置，

在冰中放置时也不要时间过长。

5. 感受态细胞的制备操作过程中，离心后弃上清时要尽量弃尽，否则会降低感受态细胞的

转化效率。

6. 使用Solution A、Solution B悬浮沉淀时要用手指轻轻弹动Microtube管壁，禁止剧烈振

荡操作。

7. 为了有效确认感受态细胞的转化效率，最好制作一批高纯度的质粒DNA分装低温 (-20℃)

保存，用作阳性对照，以确认每批制作的感受态细胞的转化效率。

PROTOCOLS & APPLICATION

Protocol

制备方法

1. 菌种纯化。

① 使用LB/抗生素平板培养基（根据菌种性质加入适当的抗生素)，用接种针挑取大肠

杆菌（-70℃甘油保存菌)，在平板培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜。

② 将上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

2. 菌体培养。

① 取20 ml φb×broth移至100 ml三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至

室温。

② 在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①的培养基中。

③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。

④ 测定OD600值，当OD600值达到0.35~0.5时（约培养5小时）放置冰中停止培养（如

果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率)。

⑤ 进行下一步操作。

3. 感受态细胞的制备

① 取上述菌体培养液1 ml于1.5 ml Microtube中（根据需要量确定Microtube数量)。

② 1,500×g (一般的微型离心机约4,000 rpm) 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽

上清)。

③ 在每个Microtube中加入100 ml冰中预冷的Solution A，轻轻弹动Microtube使沉淀悬

浮，禁止剧烈振荡。

④ 1,500×g (一般的微型离心机约4,000 rpm) 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽

上清)。

⑤ 在每个Microtube中加入100 ml冰中预冷的Solution B，轻轻弹动Microtube使沉淀悬

浮，禁止剧烈振荡。

⑥ 感受态细胞制作完成。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于

-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。

感受态细胞的DNA转化

1. 将-80℃保存的感受态细胞置于冰中融化10分钟。

2. 取100 ml的感受态细胞移至新的转化管中。

3. 向感受态细胞中加入0.1 ng ~ 10 ng (3 ml ~ 10 ml) 的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置

30分钟。

4. 42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1 ~ 2分钟。

5. 加入890 ml 37℃预温的SOC培养基。

6. 37℃振荡培养1小时。

7. 取适量涂平板后，将平板倒置于37℃培养箱中培养一夜。

8. 确认培养菌落，进行下步实验。

Application

实验例

使用本试剂盒按标准操作方法制备了E.Coli K802感受态细胞，使用pUC19质粒1 ng转化至E.Coli K802感受态细胞中，在含有Amp抗性的L-琼脂平板培养基上形成单菌落，计算菌落数及转化效率，结果见下表。

表. E.Coli K802感受态细胞的转化效率