Small RNA Cloning Kit

DRR065

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3,650 元

制品说明

近几年的研究表明，在细胞内发现的RNA中有许多是非编码RNA，它们有着重要的功能，这些RNA被称为功能性RNA，其中倍受关注的是18~26个碱基的低分子RNA，这些低分子RNA的功能有：

① mRNA水平抑制基因表达。

② 翻译水平抑制基因表达。

克隆是分析低分子RNA的有效方法之一。由于低分子RNA不具有PolyA tail，需在低分子RNA的5' 端和3' 端分别加上RNA接头或者RNA/DNA杂合形式的接头，经RT-PCR后便可以进行克隆。

Small RNA Cloning Kit是根据以上原理，对低分子RNA进行cDNA扩增的试剂盒，经本试剂盒扩增的cDNA可以用于各种载体的克隆。

试剂盒中备有MAGNOTEX-SA，利用磁珠吸附的原理，通过简单的磁珠吸附操作即可纯化低分子RNA反转录得到的cDNA，省去了切胶回收等复杂操作步骤。扩增得到的cDNA可以直接用于TA克隆，或者利用接头中带有的酶切位点进行克隆。

使用本试剂盒对Small RNA进行克隆时的操作流程见图1，详细步骤如下：

⑴ 将Small RNA进行BAP处理，5' 端去磷酸化。

⑵ BAP处理后的Small RNA的3' 端与生物素化的RNA/DNA接头连接。

⑶ 用标记Strepto avidin的磁珠，回收带有生物素的RNA/DNA接头的Small RNA，然后进行5' 端磷酸化反应。

⑷ 将5' 端连接上RNA/DNA嵌合的接头后，使用RT Primer和M-MLV反转录酶进行反转录反应。

⑸ 从磁珠上回收合成的cDNA后，进行PCR反应。

⑹ PCR片段或经限制酶酶切后的DNA片段的回收、克隆。

各种引物及Control RNA的碱基序列

Limited Use Label License: [M57], [L15], [P1]

图1. small RNA克隆流程图

本试剂盒以外需准备的主要试剂及器具

● 试剂

苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1，v/v/v）

氯仿/异戊醇（24 : 1，v/v）

乙醇; 0.1 N NaOH

TE Buffer (10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA、pH 8.0)

DNA Size Marker: 如20 bp DNA Ladder (TaKaRa Code: D521) 等

RNA Size Marker: 如14-30 ssRNA Ladder Marker (TaKaRa Code: D3416) 等

10% Polyacrylamidegel (未变性)

15% Polyacrylamidegel (变性)

Sse8387 I 限制酶 (TaKaRa Code: D1183A/B)

克隆用载体; 感受态细胞

Ligation用试剂：如DNA Ligation Kit<Mighty Mix> (TaKaRa Code: D6023) 等

Small RNA精制试剂：如Small RNA Gel Extraction Kit (TaKaRa Code: D9106) 等

● 器具

Magnetight Stand: Magnetight Separation Stand (Novagen Code: 69964-3) 等

微型离心机

恒温水浴或加热块（需适用于15℃、25℃、37℃、42℃、70℃等温度的设定）

Micropipetman

适当型号的Tube、Tip等

Thermal Cycler; PCR用0.2 ml Tube; 带过滤嘴的Tip

Agarose电泳装置

Polyacrylamidegel电泳装置

使用前的准备及注意事项

1. 器具灭菌方法

购买的一次性塑料器具通常认为RNase-free，在实验中可以直接使用。但离心Tube和移液枪枪头等必须经过高压灭菌处理后才可使用。玻璃器具、刮勺等要160℃干热灭菌2小时以上。不能进行干热灭菌的要用DEPC水在37℃处理12小时后再高压灭菌处理（防

止RNA甲基化）后才能使用。RNA实验用的器具要与其它器具严格分开。混入RNase的最大可能是用手直接接触，所以进行RNA相关实验时，必须戴手套和口罩等。

2. 试剂配制方法

试剂尽可能用0.1%的DEPC水处理、高压灭菌后使用。如果含有不能高压灭菌的试剂时,用预先灭菌的器具和水配制后，再进行过滤灭菌操作。所有的溶液和蒸馏水均应RNA专用。

3. RNA样品的制备

应尽量抑制Total RNA的降解。以细胞和组织为样品制备RNA时动作要迅速。实验前的细胞和组织样品应保存在-80℃冰箱或液氮中。

(1) Total RNA的制备

使用氯化铯密度离心法和AGPC法或者购买RNA分离精制用的试剂和试剂盒。使用成品试剂盒时首先要确认是否能回收低分子的RNA。可使用如：RNAiso (TaKaRa Code: D312)、Sepasol-RNA (nacalai tesque)、TRIzol Reagent (Invitrogen) 等提取Total RNA。

(2) Small RNA的纯化

Small RNA分离纯化经常使用聚丙烯酰胺变性凝胶 (15% acrylamide: bisacrylamide (19:1) /7 M Urea/0.5×TBE凝胶等)。Marker可以使用14-30 ssRNA Ladder Marker (TaKaRa Code: D3416)。

小片段RNA切胶回收试剂盒可以使用Small RNA Gel Extraction Kit (TaKaRa Code: D9106)；进行乙醇沉淀时，请使用10 ml RNase free dH2O溶解RNA。

实验操作

Protocol 1

1. Small RNA的BAP处理

1) 在1~100 ng 的Small RNA 中加入RNase free dH2O，总量至42 ml。

2) 在Microtube中配制如下反应液：

3) 使用Micropipetman轻轻混匀后，37℃反应1小时。

4) 加入50 ml 的RNase free dH2O，将总体积调至100 ml 后，再加入等量的苯酚/氯仿/

异戊醇，在振荡器上振荡5~10秒钟，使其充分混匀。

5) 4℃ 15,000 rpm离心5分钟，将上清(水层)转移到新的Microtube中。注意不要取到中间层。

6) 再次加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇混匀后，离心回收上层。

7) 加入等量的氯仿/异戊醇，在振荡器上混匀5~10秒钟。

8) 4℃ 15,000 rpm离心5分钟，将上清（水层）转移到新的Microtube中。

9) 向上清中加入1/10体积的3 M Sodium Acetate、4 ml 的Dr.GenTLE Precipitation Carrier、

2.5倍体积的乙醇，充分混匀。

10) -80℃放置1小时后，4℃ 15,000 rpm离心1小时，轻轻除去上清，保留沉淀。

11) 用80%乙醇清洗沉淀。

12) 风干后（注意不要过于干燥），用14 ml 的RNase free dH2O溶解。

2. 3' Adaptor的连接

1) 在Microtube中配制如下反应液：

2) 加入30 ml 的T4 RNA Ligation Buffer，用Micropipetman混匀（此Buffer比较粘，操作

时要注意）。

3) 加入1 ml 的T4 RNA Ligase，用Micropipetman充分混匀。

4) 15℃反应1小时。

3. MAGNOTEX-SA的吸附

1) 移取210 ml 的 2×B/W Buffer到Microtube中，再加入210 ml 的RNase free dH2O配制成

1×B/W Buffer。

2) 将MAGNOTEX-SA (Magnet Beads) 充分混匀后，取10 ml 至新的离心Microtube中。

3) 将Tube置于Magnetight Separation Stand上，静置30秒钟后去上清。

4) 加入10 ml 的2×B/W Buffer，在振荡器上轻轻混匀后，置于Magnetight Separation

Stand上，静置30秒钟。(B/W Buffer中含有Tritonx-100，易起泡，但对反应没有影响)。

5) 弃上清，加入50 ml 的2×B/W Buffer。

6) 向上述2.的连接反应液中加入50 ml 上述5) 中制备的Magnet beads，充分混匀。

7) 25℃静置1小时。

8) 反应结束后，将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟。

9) 弃上清后，加入100 ml 的 1×B/W Buffer，用Vortex短时间振荡，使Beads混匀。

10) 将Microtube在Magnetight Separation Stand上静置30秒钟，弃上清。

11) 加入100 ml 的RNase free dH2O,轻轻混匀。此水溶液在进行下步实验之前不要去除。

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