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PCR法的原理 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一种体外扩增DNA的方法。通过以下三个步骤： | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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循环往复，可在短时间内扩增DNA达105倍以上。TaKaRa Taq是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶，是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后，分离提取得到的，与野生型DNA polymerase具有相同的功能。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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图1 PCR法的原理图 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Step 1 : (Step 2 : (Step 3 : (Step 4 : | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性 (94℃、30 sec) 引物与热变性生成的单链DNA退火 (55℃、30 sec) 在DNA聚合酶作用下合成互补链 (72℃、1 min) 扩增的双链DNA再次热变性生成单链DNA (返回Step 1) | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Step1~4称为一个循环，如此循环往复25~30次。 注）不同的DNA片段要达到最高的扩增效率，需要设定不同的反应条件。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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PCR法不仅仅局限于分子生物学，还因其简便、迅速等特点被广泛应用于医学、法医学、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LA PCRTM 〈PCR法的最新技术〉 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1. | 可信度 (Fidelity) | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高, PCR反应有时会出现错配 (Misincorpora- tion) 现象，因而PCR克隆、变异导入等实验中，需加以注意。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2. | 扩增的DNA长度 | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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3. | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
扩增量 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常 达不到要求。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
为解决以上难题，TaKaRa在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上，开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kbp 的DNA片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围, 可在Genome解析、基因诊断、长片段 DNA的克隆及变异导入等方面发挥优势。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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LA PCR的原理 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LA PCR的关键是具有3'→5' Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
在PCR过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3'→5' Exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去, 使长链DNA的扩增成为可能。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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图2 LA PCR的原理图 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Hot Start PCR的原理 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hot Start PCR法是提高PCR特异性的最重要方法之一。这种方法可以防止在PCR反应第一步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而可以提高目的DNA片段的扩增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version，TaKaRa Ex Taq Hot Start Version,TaKaRa LA Taq Hot Start Version，PrimeSTAR HS DNA polymerase是抗体和DNA聚合酶的混合制品。抗体在高温加热前与聚合酶相结合，抑制聚合酶的活性。在PCR反应最初的DNA变性步骤，抗体变性，聚合酶活性恢复。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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图3 Hot Start PCR的原理图 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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问答 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LA PCR的反应条件? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
循环次数 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25 ~ 30个循环。 如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Denature温度与时间 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Denature时间太短或温度太低时会出现Smear、扩增效率低；Denature时间太长或温度太高时，有时会得不到扩增产物。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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合适的Anneal温度通常在45 ~ 68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于TaKaRa LA Taq在60 ~ 68℃间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2段温度PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒 ~ 1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成；而Extension时间太长时，会出现Smear。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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选择LA PCR引物 (Primer) 时的注意事项? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高，扩增20 kbp没有问题，但如果可能的话，建议设计30 ~ 35mer左右。使用特异性低的Primer时，会出现很多非特异性产物。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LA PCR时酶的使用量? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
50 ml的反应体系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时，易发生非特异性反应，出现Smear；而酶量过少时，反应性能下降。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LA PCR时模板DNA的调制方法? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kbp的DNA片段时，用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适， 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick等)。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
是否可以对l 噬菌体直接进行LA PCR反应? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约106 ~ 107 pfu作为模板，至少可扩增8 kbp的DNA片段。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
对Mammalian cell或E. coli只进行热处理 (98℃, 2 min) 或Protease处理的样品可否进行LA PCR? | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
对E. coli只进行热处理可扩增10 kbp的DNA片段 (50 ml PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both使用2 ml)。 Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理，可扩增数百bp；经过Protease处理、 热处理后的样品，最多可扩增1 ~ 2 kbp。所以，如果要扩增长链DNA，建议使用 经过充分精制的完整的DNA作模板。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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使用LA Taq是否也产生A的Overhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?) | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
可以。使用TaKaRa LA Taq及TaKaRa Ex Taq时的PCR产物产生A的Overhang，与使用TaKaRa Taq时的PCR产物克隆于T-vector的效率基本相同。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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