DR040A

100 次 (50 ml PCR)

500 元

制品说明

本制品是PCR反应用的DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture的2倍浓度的混合物。DNA Polymerase使用了TaKaRa独自开发的兼具高保真性和高扩增效率的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。使用本制品时，只需在制品溶液中加入模板和引物便可以进行PCR反应，大大简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染。PrimeSTAR HS DNA聚合酶具有极强的3' →5' Exonuclease活性，显示出超群的校正功能，同时还具有优于Taq DNA Polymerase的高扩增效率，其扩增得到的PCR产物几乎都为平滑末端，经磷酸化后可直接克隆于平滑末端的载体中。

PCR性能

以lDNA为模板，可以很好地扩增8、10、12、15 kbp的DNA片段。　　　　　

以人基因组DNA为模板，可很好地扩增0.5、1、2、4、6、8 kbp的DNA片段。

用途

高保真PCR扩增DNA片段。

Limited Use Label License: [M54], [L15], [P1]

Application

A. 以人基因组DNA为模板进行PCR扩增。

1. 模 板：人基因组DNA 50 ng（50 ml反应体系)。

PCR仪：TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice。

实验例

2. PCR条件：

3. 结果

B. 以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。

1. 模 板：大肠杆菌基因组DNA 100 ng（50 ml反应体系)。

PCR仪：TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice。

2. PCR条件：3 Step PCR

3. 结果

问答

可以从以下几个方面考虑。

1. 引物长度通常为20～25mer。但进行LA PCR时, 引物长度应增长为30～35mer。

2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3'端的3个碱基需特别注意。

3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3'端

应避开AT rich结构。

4. 避开引物自身形成二级结构。

5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

引物为20mer以下时：

Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)

引物为20mer以上时：

Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L

其中L为引物的长度。

在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。

可以不考虑Inosine碱基，使用A、G、C、T计算Tm值就可以。

合适的终浓度可在0.1 lM ~ 1.0 lM之间选择。引物的浓度太低时, 有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等) 作模板时，引物浓度应高一些。

有影响。简并数量应尽量少。

通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

50 ml PCR反应体系中模板DNA推荐使用量:

可以。根据本公司的实验数据，以上三种PCR用DNA Polymerase的PCR扩增产物和TaKaRa Taq一样，在DNA片段的3'端有一个附加的 "A" 碱基 (A Overhang)，可以进行TA克隆。

需要。一般的PCR用引物5'末端都不带磷 (除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后，与去磷酸的平滑末端载体连接之前，PCR产物必须进行5'末端磷酸化。

TaKaRa Ex Taq和TaKaRa LA Taq有什么区别?

TaKaRa Ex Taq和TaKaRa LA Taq都具有3'→5'的Exonuclease活性，但这种活性TaKaRa LA Taq强于TaKaRa Ex Taq。因此，TaKaRa LA Taq的可信度强于TaKaRa Ex Taq，因而适合于进行Long PCR。一般来说，在扩增数kbp的DNA片段时，从灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性等方面综合考虑，使用TaKaRa Ex Taq较佳；而扩增15 kbp以上的DNA片段时，使用TaKaRa LA Taq更好。

PCR产物需用限制酶进行消化时，需不需要进行Buffer交换?

在通常情况下，首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分 (1 ~ 5 ml) 进行酶切反应时，可以不经纯化使用TaKaRa限制酶进行20 ml体系的酶切反应。

进行LA PCR时，为什么推荐使用2阶段温度PCR法?

Long PCR成功的关键之一是设计30 mer以上的长引物，以增加引物的特异性。而长引物的Tm值一般较高，在进行PCR反应时，Annealing温度和Extension温度间的差距较小。当Annealing温度超过60℃时，Annealing温度和Extension温度就可以设定在同一数值，此时进行2阶段温度PCR反应，效果颇佳。

当使用20 mer左右的引物进行Long PCR时，进行3阶段温度PCR反应较好, 20 mer 左右的引物也在诸多实验中成功地进行过Long PCR。

TaKaRa LA Taq with GC Buffer的Buffer使用方法如何?

TaKaRa LA Taq with GC Buffer的制品包装中添附有GC Buffer I 和GC Buffer II。其中GC Buffer II 的DNA变性效果强于GC Buffer I，因此, 在实验时可先使用GC Buffer I，当使用GC Buffer I 不能进行PCR扩增时再使用GC Buffer II。

使用TaKaRa LA Taq with GC Buffer扩增GC rich模板时应注意些什么?

应注意使用Tm值较高的引物，因此，引物最好设计在30 mer以上。

TaKaRa LA Taq with GC Buffer可以扩增多长的GC rich模板?

TaKaRa公司曾经扩增过2 kbp的GC含量在70%的DNA模板。同时也可应用于200 bp ~ 300 bp的短链DNA GC rich模板。

TaKaRa LA Taq with GC Buffer可否使用其GC Buffer扩增非GC rich的DNA模板?

TaKaRa公司曾用GC Buffer I 成功地扩增了人基因组DNA 17.5 kbp的DNA片段（GC含量50%）和lDNA 35 kbp的DNA片段。但由于GC Buffer和一般的PCR用Buffer相比DNA变性效果较强 (特别是GC Buffer II)。因此，一般的DNA模板使用GC Buffer进行PCR扩增时,有时会降低PCR扩增效率。

TaKaRa LA Taq是否只可以扩增长片段DNA?

不是，TaKaRa LA Taq酶进行短片段DNA扩增时，其扩增性能仍然很好。 如果常规PCR难以进行扩增时，可以尝试使用TaKaRa Ex Taq酶、TaKaRa LA Taq酶等，有时会得到非常好的结果。

使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR反应时的注意点?

1. 在配制反应液时，请在加入dNTP Mixture后再加入Pyrobest DNA Polymerase。因

为本酶的3'→5' Exonuclease活性较强，反应液中如果不含dNTP，反应液中的引物有可能被分解。

2. PCR反应液请在冰中配制，并在配制后尽快进行反应。

使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增后的PCR产物可否直接进行TA克隆?

不可以。使用Pyrobest DNA Polymerase进行PCR扩增后的PCR产物3'端不附加 "A" 碱基，大部分为平滑末端。如果把使用本酶扩增的PCR产物克隆于去磷酸的平滑末端载体时，PCR产物必须进行5'末端磷酸化 (引物在合成时已进行5'末端磷酸化除外)。

Pyrobest DNA Polymerase的PCR扩增的可信度 (Fidelity) 是通常的Taq DNA Polymerase的几倍?

根据TaKaRa公司的实验结果，Pyrobest DNA Polymerase的PCR扩增的可信度是通常的Taq DNA Polymerase的10倍。

Pyrobest DNA Polymerase可以扩增多长的DNA片段?

根据TaKaRa公司的实验结果，使用Pyrobest DNA Polymerase成功地扩增了5 kbp 的人染色体DNA片段和12 kbp的lDNA片段。

Premix系列产品的保存方法?

分装成小管后于-20℃保存，在4℃时不太稳定。

电泳时出现Smear，为什么?

PCR产物中出现很多非特异性DNA带，为什么?

可能有以下原因