E-21.FH11

DRR013A

50 次

800 元

制品说明

PCR（Polymerase Chain Reaction）法是一种体外快速扩增DNA的简单而有效的方法。在现代分子生物学研究中，PCR法广泛应用于DNA的扩增、DNA重组、基因克隆以及DNA测序等多种领域。但是，一般PCR法具有一定的局限性，特别是难以扩增5 kbp以上的长链DNA，这严重限制了PCR法的推广和应用。我们通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等，使48 kbp的长链DNA的扩增成为可能，这就是LA（Long and Accurate）PCRTM技术。LA PCR技术的开拓，为PCR技术的推广提供了有力保障，特别是在基因组DNA研究方面展现了广阔的前景。

本制品可以以基因组DNA为模板扩增长链DNA片段。此外，本制品中还配备了GC rich专用Buffer（GC Buffer I、GC Buffer II)，可以对扩增GC rich的DNA片段、DNA重复序列、具有复杂立体结构的DNA片段等发挥强大威力。

当然，本制品同样适用于扩增一般的DNA片段，反应性能强。并且在本试剂盒中含有Mg2+ Free Buffer，可以通过调整Mg2+的浓度，确定最佳的PCR反应体系。

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Control Primer序列

*1 Control Primer LA3和Control Primer LA4可以扩增Control Template的17.5 kbp片段。

*2 Control Primer GC1和Control Primer GC2可以扩增Control Template的1,255 bp的GC rich区域。

Limited Use Label License: [M57], [P1]

Protocol

模板DNA的质量是LA PCR成功与否的关键之一。超过10 kbp以上的LA PCR扩增反应，不适合使用采取简单方法（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）提取的DNA作为模板。建议使用经过充分纯化的完整DNA（没有Nick等）作为模板。

从全血中提取DNA时，可使用Genome DNA Extraction Kit（TaKaRa Code: D9081)，操作十分方便。

Control模板的PCR扩增

扩增长片段DNA

以Control Template DNA为模板，Control Primer LA3 / Control Primer LA4为引物，扩增Control Template的17.5 kbp的DNA区域。

1. 按下列组份配制PCR反应液。

2. 按以下条件进行PCR反应。

3. 反应结束后，取5 ~ 10 ml PCR反应液进行0.5%的琼脂糖凝胶电泳，可以确认到17.5kbp

的PCR扩增产物。

扩增GC rich的DNA片段

以Control Template DNA为模板，Control Primer GC1 / Control Primer GC2为引物，扩增Control Template的1,255 bp的DNA GC rich区域（GC含量65%)。

1. 按下列组份配制LA PCR反应液。

2. 按以下条件进行PCR反应。

3. 反应结束后，取5 ~ 10 ml PCR反应液进行1%的琼脂糖凝胶电泳，可以确认到1,255bp的

PCR扩增产物。

Application 1

以Human genome DNA为模板的LA PCR反应

1. 按下列组份配制LA PCR反应液。

2. 按以下条件进行PCR反应。

3. 反应结束后，取PCR反应液5 ml 进行0.5%的琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。电

泳结果如下，在17.5 kbp、21.5 kbp位置处有明显的PCR扩增产物。

Application 2

TaKaRa LA Taq 和GC Buffer以及LA Buffer II分别组合, 与B公司制的GC Kit进行比较，扩增舞蹈病基因 (HD基因IT15 CAG重复; 262 bp/GC含量73%, 358 bp/GC含量71.5%)。

结果，使用LA Buffer II和B公司制的GC Kit，都没有目的DNA条带，而使用GC Buffer时, 有两条清晰的目的DNA条带检出。

扩增Huntington's disease gene

(高GC含量DNA模板)

问答

TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1的PCR条件，为何建议设定2段温度PCR?

Long PCR成功与否的关键之一，是设计30mer左右高特异性的长引物。因为长引物Tm值高，PCR反应的Annealing和Extension温度差很小。当Annealing温度超过60℃时，不设定3段温度，而将Annealing和Extension在同一温度进行，即进行Shuttle PCR的2段温度PCR，能得到好的反应结果。而TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1是专为Long PCR设计的Kit，所以建议使用Shuttle PCR条件。如使用20mer左右的引物，则仍设定3段温度PCR为好。当然，Shuttle PCR有时使用20mer左右的引物成功的例子也有。

是的，3'末端有"A"。所以PCR产物可直接进行TA Cloning。或使用Blunting Kit将末端平滑以及经T4 Polynucleotide Kinase磷酸化后，克隆于平滑末端的载体上。如使用TaKaRa BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit, TaKaRa Code: D6127)，能迅速、简单地进行平滑末端克隆。