DRR015

10 次

900 元

制品说明

本试剂盒利用PCR法，使用Cassette以及Cassette Primer，可特异性地扩增cDNA或基因组上的未知区域。通过应用LA PCR技术，使以往扩增效率较低的长链未知区域的扩增变得简单，而且提高了保真性能。使用本试剂盒，不必经过繁杂的文库构建及筛选等，就能简单地得到基因组等上的长链目的DNA，并可减少变异点的导入。

保存

-20℃

Limited Use Label License: [M57], [P1]

Cassettes & Cassette Primer序列

Sau3A I Cassette

EcoR I Cassette

Hind III Cassette

Pst I Cassette

Sal I Cassette

Xba I Cassette

Cassette Primer C1

Cassette Primer C2

本试剂盒进行DNA扩增的原理

具体原理见图1。因为在设计上，Cassette的5' 末端没有磷酸基，所以Target DNA的3' 末端和Cassette的5' 末端的连接部位形成缺口。在第一次PCR反应的第一个循环时，从Primer C1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之间的扩增， 从而控制了非特异性PCR扩增。只有从Primer S1开始延伸合成的DNA链，才能成为Primer C1的模板，进行DNA的特异性扩增反应。再用内侧Primer（Primer C2，Primer S2）进一步进行第二次PCR反应，可以高效特异性地扩增目的DNA。

当蛋白质的氨基酸序列已知时，可以根据已知信息设计Mixed primer，扩增编码蛋白质的cDNA。

本试剂盒原理的具体步聚如下：

1）用适当的限制酶将待克隆的Target DNA完全分解。

2）与具有对应的限制酶酶切位点的Cassette进行连接反应。

3）用Cassette Primer（Primer C1）和根据已知区域的DNA序列设计的Primer（Primer

S1)，进行第1次PCR（1st PCR）反应。

4）取3）的PCR反应液的一部分作模板，使用内侧Primer（Primer C2和Primer S2）进

行第2次PCR（2nd PCR）反应，特异性地扩增目的DNA片段。

图1 特异性PCR扩增原理图

Note

Specific Primer (S1, S2) 的设计标准

1）根据已知区域设计Primer（见图2)。设计方向为需要扩增的未知区域的方向。S2的位

置应设计在S1的内侧，两个引物间的距离没有严格的规定。

使用注意

图2 特异性引物设计位置图

设计引物时还需要注意以下几点：

● 引物长度为20～35mer（扩增长链DNA时最好为30～35mer)。

● GC含量在50%左右，避免局部GC或AT集中。特别是引物的3' 端不要AT集中。

● 引物自身不要形成发夹等明显的二级结构。

● 两个Specific Primer（S1、S2）要与Cassette Primer（C1、C2）组合使用，所以

设计时还要考虑不要与配对的引物形成引物二聚体，特别是3' 端的3、4个碱基不要与配对的引物序列互补。

2）根据蛋白质的氨基酸序列进行设计引物时应注意以下几点：

● 首先将氨基酸序列转换成编码氨基酸的碱基序列。应尽量选择简并少的区域设计引

物，但与简并少而较短的引物相比，还不如使用简并多而较长的引物比较合适。

● 如果想减少引物简并，可考虑Codon usage进行设计。

● 3' 末端不要简并。

● 如果使用Mixed primer进行PCR扩增时，需要将退火温度降低，而其结果往往会引

起非特异性的扩增。如果有关DNA序列信息较多时，可进一步在内侧再设计一个引物，用以鉴定目的DNA片段。

Protocol

A. DNA的限制酶酶切反应

1. 按下列组份配制限制酶酶切反应液。

PCR扩增实验例

* 使DNA完全分解的必要酶量，根据制备的DNA纯度而定，一般10 U分解1 mg DNA。

2. 37℃保温3～5小时。

3. 反应结束后，进行乙醇沉淀回收DNA。

4. 溶解于10 ml的灭菌蒸馏水中。

B. 连接反应

1. 按下列组份配制连接反应液。

*

使用Sau3A I Cassette与使用6个碱基酶切位点的限制酶 (BamH I、Bgl II、Fba I、Mfl I) 分解的DNA连接时，需将Sau3A I Cassette稀释10倍使用。

2. 16℃反应30分钟。

3. 反应结束后，进行乙醇沉淀回收DNA。

4. 溶解于5 ml的灭菌蒸馏水中。

C. PCR扩增

1. 将B.-4.的DNA溶液1 ml加入33.5 ml灭菌蒸馏水中，94℃加热10分钟。

2. 按下列组份配制1st PCR反应液。

3. 按以下条件进行1st PCR反应。

或 [扩增长链DNA fragment (4 kbp以上) 时]

4. 用灭菌蒸馏水将C.-3.的PCR反应液按适当倍数稀释 (1 ~ 10,000倍稀释)，再取1 ml进行

2nd PCR反应，2nd PCR反应液组份如下。

5. 按以下条件进行2nd PCR反应。

或 [扩增长链DNA fragment (4 kbp以上) 时]

6. 反应结束，取PCR反应液（5 ~ 10 ml）进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增片段。如果

此时PCR产物需用于以后实验，须将PCR产物冷冻保存。

Application

原理

Human genome DNA b-Globin

region 9.3 kbp片段的扩增

结果

图3 2nd PCR扩增电泳图

问答

1) 利用PCR法，克隆cDNA和基因组上的DNA。

2) 利用Cassette上的T7启动子，在体外合成RNA探针。

3) 用Dideoxy法，使用Cassette Primer, 将克隆的DNA测序。

1)

2) (3)

S1、S2重叠也可以，但为了获得高特异性扩增，最好不要重叠。

1st PCR反应后，有时电泳看不到DNA亮带，此时，请继续进行2nd PCR。

基因组Walking时，使用Sau3A I 成功率较高。

因为Sau3A I 是具有4个碱基识别位点的限制酶，在以基因组DNA为实验材料时，用Sau3A I 酶切产生的Genome DNA片段数较多，因此，需要的Cassette的量也相应增多。

进行LA PCR时应注意什么?

请参见LA PCR的Q & A (E-3页)。