D6110

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本制品是使用PrimeScript RTase从Total RNA或Poly(A)+ RNA合成1st Strand cDNA的试剂盒，含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂。

PrimeScript Reverse Transcriptase是TaKaRa公司独自开发的一种新型RNase H-型反转录酶。本酶具有极强的延伸能力，能够有效合成长达12 kbp的1st Strand cDNA，即使对具有复杂二级结构的RNA，在42℃条件下也能得到良好的反转录效果，无需进行高温反转录反应（高温反转录反应会导致RNA的降解)。

合成的1st Strand cDNA可广泛应用于2nd Strand合成、杂交、PCR扩增、Real Time PCR反应等。

各引物的序列

* 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa Code: DRR019A) 的Oligo dT Adaptor

Primer不同，不含有M13 Primer M4对应序列。

Protocol

1. 在Microtube中配制下列混合液。

实验操作程序

2 kb以上的长片段cDNA合成时，Random 6 mers引物的使用量为0.4 ml (20 pmol)。

Real Time PCR反应时，Random 6 mers引物使用2 ml (100 pmol) 可以得到较好的实验结果。

Total RNA的使用量小于5 mg；Poly(A)+ RNA的使用量小于1 mg。

Real Time RT-PCR反应时，Total RNA的最大使用量为1 mg。

2. 在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：

3. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

4. 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：

以Random Primers作为反转录引物时，应先进行30℃，10分钟反应。

PrimeScript Reverse Transcriptase延伸能力强，通常情况下，即使模板RNA具有复杂的二级结构，也可以在42℃下进行反转录反应。但当反转录引物使用PCR的下游引物时，由于引物错配的原因等易发生非特异性扩增，这时可以将反转录温度设为50℃。