DRR014A

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1,200 元

制品说明

PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

PrimeScriptTM RT-Kit 是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。反转录反应使用了TaKaRa独自开发的新型反转录酶PrimeScript RTase ；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS。

本试剂盒具有以下特点：

1. 进行高效的RT-PCR扩增。

2. 在标准的RNA反转录反应温度(42℃)下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，

可以避免RNA在高温条件下的降解。

3. 能有效抑制非特异性的PCR扩增。

4. 使用本试剂盒扩增得到的目的产物3' 端附有一个A 碱基，可以直接克隆于T-Vector中。

本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。

各引物的序列

Limited Use Label License: [M57], [L15], [P1]

*4 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa Code: DRR019A) 的Oligo dT Adaptor

Primer不同，不含有M13 Primer M4所对应的序列。

Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA（约1.4 kb）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。

图1 Positive Control RNA:

使用各Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段

RNA PCR的原理

PrimeScriptTM RT-PCR Kit 首先用PrimeScript RTase将RNA合成cDNA，再取反应液的一部分作为模板，由TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增。将RNA反转录成cDNA的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物等。

图2 PrimeScriptTM RT-PCR Kit RNA PCR的原理

图3 PrimeScriptTM RT-PCR Kit 的操作流程

反转录反应时Primer的选择

反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。

特长

Protocol

A. 反转录反应

实验操作程序

1. 在Microtube管中配制下列混合液。

合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT Primer、Random 6 mers、Specific Primer中任选一种，请参照“反转录引物的选择”。

Template RNA最多可加至8 ml，当使用Total RNA时，最多可加至5 mg。(推荐使用量：100 pg~ 1 mg)。

2. 在PCR仪上进行变性、退火反应。

65℃ 5 min

(说明：变性、退火操作有利于反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率。）

3. 离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5. 按以下条件进行PCR反应。

*3 反转录反应引物为Random 6 mers时进行，此操作可使Random 6 mers在42℃(*50℃)和模板

RNA充分退火、延伸，增加反转录效率。

*4 进行长片段DNA扩增时，为了避免破损1st cDNA链，请进行70℃、15 min 的失活反应。

(说明：PrimeScript RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将温度升到50℃，可能会减少非特异性扩增。）

B. PCR反应

1. 按下列组成配制PCR反应液。

*5 Positive Control RNA使用F-1 Primer。

*6 Positive Control RNA使用R-1 Primer。

2. 反应条件

*7 反转录引物使用Oligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primer中的任何一种引物，在进行PCR

扩增时使用Control Primer F-1和R-1引物都可以得到462 bp的PCR扩增产物。