TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0

DRR019A

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制品说明

PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。

本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A)+ RNA 3'端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。

各引物的序列

Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA（约1.4 kb）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。

Limited Use Label License: [M57], [L15], [P1]

图1 Control RNA:

使用各Primer所扩增的DNA片段

RNA PCR的原理

本试剂盒使用AMV由来的反转录酶由RNA合成cDNA，并可在同一反应管中使用TaKaRa Ex Taq HS扩增此cDNA。Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物等均可作为反转录引物用于cDNA合成。Oligo dT-Adaptor Primer同时适用于3'-RACE实验。

图2 RNA PCR的原理

反转录反应时Primer的选择

用于反转录的Primer可视实验具体情况选择Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor及特异性下游Primer。对于不具有Hairpin构造的短链mRNA，3种引物中任何一种都可以，但一般按如下方法进行选择。

特长

Protocol

A. 反转录反应

实验操作程序

合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT-Adaptor Primer、Random 9 mers或特异性下游引物中任选一种。

1. 按下列组成配制反转录反应液。

2. 按以下条件进行反转录反应。

此反应体系中已经加入了足够量的dNTP Mixture，PCR反应时不需要再添加dNTP Mixture。

Reverse Transcriptase能与cDNA结合，直接进行PCR反应有阻害作用。因此，PCR反应前，必须进行99℃、5分钟加热使Reverse Transcriptase失活。反应液中Reverse Transcriptase的浓度增加会使失活变得困难，在使用长链RNA进行反转录反应时，不要增加Reverse Transcriptase的量，可将延伸反应时间延长。

使用Random 9 mers时，先进行30℃保温10 min，使Random 9 mers达到足够长度，以便在

42℃～55℃退火时与模板RNA充分结合。

AMV由来的Reverse Transcriptase，即使在55℃下也能进行反转录反应。但在反转录长链RNA (＞2 kb) 时，建议在42℃左右进行。

B. PCR反应

1. 按下列组成配制PCR反应液。

*5. 反转录反应时如使用了特异性下游PCR引物，可用0.5 ml灭菌蒸馏水代替下游PCR引物。

2. 把1. 的反应液加入到A-2.反转录结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。

3. 按以下条件进行PCR反应*6。

*6. PCR条件设定

退火温度

可根据实际情况适当地提高或降低退火温度 (50℃～65℃)。

延伸时间

延伸时间因目的序列长度的不同而不同，通常TaKaRa Ex Taq HS按1 kbp/min设定延伸时间。

循环次数

cDNA量较少时，循环次数可增加为40～50次。

4.

反应结束后，取反应液 (5 ~ 10 ml) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

Note

当同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (MasterMix； 其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。 同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。

使用Reverse Transcriptase（AMV)、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq HS酶等酶类时， 应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。

酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。

为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于 -70℃～-80℃。

分装试剂时务必使用新的枪头（Tip)，以防止样品间污染。

最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control反应，以确定最佳的PCR条件。

使用注意

问答

首先应严格按说明书要求，进行Control反应。如Control反应情况正常，那说明实验操作方面没有问题。应从您提取的RNA样品的纯度和添加量、引物的设计情况、参考文献的可信度以及RT-PCR条件的设定等方面加以考虑；如Control反应不正常，应从实验操作的准确性、实验器具处理、PCR仪的条件设定等方面加以考虑。

RT反应后的PCR反应体系中，不加dNTP Mixture，为什么?

由于在RT反应体系中已经加入了足够量的dNTP Mixture，因此在PCR反应时，不需再添加dNTP Mixture。如果在PCR反应时继续添加了dNTP Mixture，虽然PCR反应仍然可以进行，但过量的dNTP有可能影响PCR反应的顺利进行，降低DNA的扩增效率。