DRR055A

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1,400 元

制品说明

PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

本试剂盒采用了一步（One Step）RT-PCR法。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂。反转录反应使用了TaKaRa公司独自开发的新型反转录酶PrimeScript^TMRTase。该反转录酶对具有复杂二级结构的RNA模板也具有超强的延伸能力；PCR反应使用了扩增性能优越的Hot Start型DNA聚合酶TaKaRa Ex TaqTM HS，大大提高了本试剂盒的扩增性能和反应特异性。在本试剂盒中，已将PrimeScriptTM RTase、TaKaRa Ex TaqTM HS、RNase Inhibitor以及One Step RT-PCR用稳定剂等配制成了Premix型的PrimeScriptTM 1 step Enzyme Mix；同时把反应用Buffer、dNTP以及One Step Enhancer Solution配制成了Premix型的2×1 Step Buffer的形式，使实验操作时的反应液配制更为简单方便。

本试剂盒具有以下特点：

1. 进行高效的RT-PCR扩增。

2. 操作简单。

3. 反转录温度可以设定为50℃，能够有效抑制非特异性扩增。

4. 使用本试剂盒扩增得到的目的产物3' 端附有一个A碱基，可以直接克隆于T-Vector中。本试剂盒中含有进行One Step RT-PCR反应用的全部试剂，可以方便有效地对RNA进行扩增分析。

各引物的序列

Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA（约1.4 kbp）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+ 尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。

图1 Positive Control RNA:

使用各Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段

RNA PCR的原理

TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2可在同一反应管中连续进行由PrimeScriptTM RTase将RNA反转录为cDNA，再由TaKaRa Ex TaqTM HS扩增此cDNA的RT-PCR反应。

图2 PrimeScript One Step

RT-PCR Kit Ver.2原理图

特长

Application

A. 扩增不同长度DNA片段的RT-PCR实验。

1. Template：Human Heart Total RNA和HL60 Total RNA。

Target：以Human Heart Total RNA为模板，扩增Dystrophin基因的6～12 kbp的DNA片段；以HL60 Total RNA为模板，扩增TFR和CCND2基因的0.5～4.4 kbp的DNA片段。

实验例

2. RT-PCR反应条件：

3.

电泳结果如下图。结果显示，0.5~8 kbp的DNA片段都得到了良好的RT-PCR扩增。

B. RT-PCR检出灵敏度实验。

1. Template：HL60 Total RNA。

Target：GAPDH 428 bp的DNA片段。

2. RT-PCR反应条件:

3.

电泳结果如下。结果显示，最低的Total RNA检出量为0.1 pg 。