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Cycleave RT-PCR Core Kit | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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DCY502 | 50 次 | 1,200 元 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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制品说明 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Cycleave RT-PCR Core Kit是采用Cycling探针法进行Real Time RT-PCR反应的专用试剂盒。该方法不仅秉承了Real Time PCR法的快速性、定量性等特点，而且还具有检出特异性高的优势。使用该方法能够准确、简便地进行mRNA表达量分析。 本制品适合于Thermal Cycler DiceTM Real Time System/Smart Cycler(R)II System/ABI PRISM System7000/7700/7900HT, 7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）等各种机种的Real Time PCR扩增仪。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
* Cycling探针法由ID Biomedical授权TaKaRa公司制造。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
适用的Real Time PCR扩增仪 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Thermal Cycler DiceTM Real Time System (TaKaRa) ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems） LightCycler(R)（Roche Diagnostics） Line-Gene（Bioer，杭州博日） Smart Cycler(R) System（Cepheid） Mx3000P (Stratagene) 其他各种Real Time PCR扩增仪 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
试剂盒原理 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Cycleave RT-PCR Core Kit使用M-MLV反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板由TaKaRa Ex Taq HS进行扩增反应，并采用Cycling探针法对扩增产物进行实时监测。 1. PCR反应。 PCR法是从微量DNA起始进行目的片段扩增的技术。将变性、退火、延伸作为一个循环，循环反复，在短时间内能够扩增近100万倍的目的基因片段。 本制品使用了Hot Start PCR用的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，能够防止非特异性片段产生及引物二聚体形成，检测灵敏度高。 2. RT-PCR。 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。 本制品是2 Step RT-PCR，其原理如图1所示。 首先以Total RNA为模板，使用Oligo dT Primer或Specific Primer（Reverse）进行反转录反应，合成cDNA。再以合成的cDNA为模板，使用Specific Primer（Forward，Reverse） 进行PCR扩增(反转录引物使用Random Primer时，Random Primer能和Cycling探针互补，Cycling探针被切断，因此反转录反应时不能使用Random Primer)。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Limited Use Label License: [M40], [M45], [M46], [M57] [L4], [L8], [L15], [P1] | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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图1 2 Step RT-PCR的原理 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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3. Cycling探针法。 Cycling探针法是由RNA和DNA构成的杂合探针与RNase H组合使用的高灵敏度检出法， 能够高效率地检出扩增过程中及扩增结束时的目的基因片段，具体原理如图2所示： Cycling探针内部含有RNA碱基、5' 端标记荧光物质、3' 端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中互补序列杂交后，RNase H在RNA碱基处切断探针，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光。 此时通过测定荧光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的RNA部分或与RNA部分相邻的2~3个碱基与模板不匹配，RNase H将不能切断探针，所以该检出方法是一种即使有一个碱基不同也能识别的高特异性检出方法。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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图2 Cycling探针法原理图 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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试剂盒特长 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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● Real Time PCR和Cycling探针法相结合，能够简便、准确地进行mRNA表达量分析。 ● 2 Step RT-PCR体系在反转录时用Oligo dT Primer，合成的cDNA可以进行多基因分析。 ● DNA聚合酶使用了TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，具有扩增效率 高、扩增灵敏度好、扩增特异性强的特点。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Application | A.反转录反应。 | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
使用Positive Control RNA进行Cycleave RT-PCR反应（使用Smart Cycler II)。 1. 按下列组份配制反转录反应液（反应液配制请在冰上进行）。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
使用Positive Control RNA时的实验例 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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2. 42℃反应10分钟（反转录反应)。 3. 95℃加热2分钟（反转录酶失活)。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
B.PCR反应。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行)。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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2. 向上述PCR反应管中加入10 ml反转录反应液进行PCR扩增反应。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3. Real Time PCR反应条件。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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4. Real Time PCR反应结果。 | | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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