制品说明

本制品是采用SYBR(R) Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。制品中已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP、SYBR Green I 等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。

本制品适合于Thermal Cycler DiceTM Real Time System、ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler(R)、 Line-Gene、Smart Cycler(R)、Mx3000P等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

适用的Real Time PCR扩增仪

Thermal Cycler DiceTM Real Time System (TaKaRa)

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems）

LightCycler(R)（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

Smart Cycler(R) System（Cepheid）

Mx3000P (Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪

Real Time PCR性能检测

1. 使用Smart Cycler System Real Time PCR扩增仪，以lDNA为模板，进行300 bp DNA

片段的Real Time PCR扩增，通过SYBR Green I荧光信号的检测，确认具有良好及稳定的Real Time PCR扩增性能。

2. 55℃条件下反应10分钟，确认抗体对Ex Taq的活性抑制效率达90%以上。

试剂盒原理

本制品使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBR Green I 的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。

1. 本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，并结合TaKaRa独自开发的

Buffer系统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。

2. 嵌合荧光检测法。

SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光， 通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

嵌合荧光法原理图

试剂盒特长

● 适用于Real Time PCR反应，可以快速正确地对目的基因进行检测、定量。

● 在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR Green I，PCR反应液配制时，只需加入模板、

引物、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。

● DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与

TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。

Application

Template

Target

实验仪器

：l DNA。梯度稀释制作标准曲线。

：检测l DNA的300 bp片段。

：Smart Cycler II System

实验例

操作方法

1. 稀释lDNA。

将lDNA按10的倍数稀释成0.05 fg/ml～500 pg/ml 的8个梯度浓度。

2. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行)。

3. 进行Real Time PCR反应。

用离心机轻轻离心PCR反应管后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应，进行Negative Control实验时的DNA模板使用了2 ml的灭菌蒸馏水，PCR反应条件如下：

4. 分析Real Time PCR扩增曲线和融解曲线。

5. 制作标准曲线。

反应结束后，由各扩增曲线得到的Ct值，制作标准曲线。

6. 结果说明。

以lDNA为模板，可以检测到0.1 fg的lDNA。对融解曲线分析可知，DNA的扩增产物非常单一，由标准曲线可以看出，线性关系良好。因此我们可以得出结论，在实验浓度范围内，可以得到非常正确的PCR定量结果。

Protocol

进行RT-PCR反应时，使用SYBR(R) PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）(TaKaRa Code：DRR063A）更为方便。SYBR(R) PrimeScriptTM RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time)（TaKaRa Code：DRR037A）和SYBR(R) Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time) (TaKaRa Code：DRR041A，即本制品)。 这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：DRR063A)，也可以单独购买。

进行RT-PCR反应时的实验例

操作方法

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制)。

使用TaKaRa Code：DRR037A的RT-Reagents试剂。

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。使用单引物

进行反转录时，使用量分别如下：

Random 6 mers (100 mM) 0.5 ml (50 pmol)

Oligo dT Primer (50 mM) 0.5 ml (25 pmol)

Specific Primer (2 mM) 0.5 ml (1 pmol)

*2 反应体积可按需求相应放大，10 ml的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

2. 反转录反应条件如下：

*3 应用Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15min。使用基因特异性下游引物进行

反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时，将温度升到50℃会有所改善。

3. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

(使用Smart Cycler System时）

4. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 ml*4的RT反应液，

保证最终反应体积为25 ml。

*4 RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

5. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

6. Real Time PCR反应结果。

Target

Template

扩增长度

：Mouse GAPDH

：Mouse Liver Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液，其量相当于1 pg～

100 ng的Total RNA量。Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。

：108 bp

7. 结果分析。

本实验检测到了Mouse Liver Total RNA 1 pg ~ 100 ng相当量的cDNA。分析融解曲线时，能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。