DRR039S

50 ml反应×120 次

1,400 元

50 ml反应×200 次

DRR039A

2,000 元

3,800 元

DRR039B (A×2)

50 ml反应×400 次

DRR039C (A×5)

50 ml反应×1,000 次

9,000 元

DRR039D (A×10)

50 ml反应×2,000 次

17,000 元

制品说明

本制品是采用探针法（TaqMan(R)，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR的专用试。制品中已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。

本制品适合于Thermal Cycler DiceTM Real Time System、ABI PRISM 7000/ 7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler(R)、Line-Gene、Smart Cycler(R)、Mx3000P等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

适用的Real Time PCR扩增仪

Smart Cycler(R) System（Cepheid）

Mx3000P (Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪

Limited Use Label License: [M57], [L15], [P7]

试剂盒原理

进行PCR扩增时，在PCR反应液中加入荧光探针，然后在PCR扩增过程中，通过检测PCR反应液中的荧光强度，可以达到监测PCR产物扩增量的目的。

1. 本制品中的DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，并结合TaKaRa独自开发的

Buffer系统，可以有效抑制非特异性PCR扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。

2. TaqMan(R)探针法

TaqMan探针法是使用5'端带有荧光物质（如：FAM等)，3'端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5'端的荧光物质受到3'端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5'端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5'→3'Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度， 可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。

TaqMan探针法原理图

Real Time PCR性能检测

1. 使用Smart Cycler System Real Time PCR扩增仪，以lDNA为模板，进行300 bp DNA

片段的Real Time PCR扩增，通过SYBR Green I荧光信号的检测，确认具有良好及稳定的Real Time PCR扩增性能。

2. 55℃条件下反应10分钟，确认抗体对Ex Taq的活性抑制效率达90%以上。

试剂盒特长

● 适用于Real Time PCR反应，可以快速正确地对目的基因进行检测、定量。

● 是一种2×浓度的Premix Type试剂，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、荧光探

针、灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应，操作简单方便。

● DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应，再与

TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。

Application

Template

Target

实验仪器

检测方法

：lDNA。梯度稀释制作标准曲线。

：检测lDNA的92 bp片段。

：Smart Cycler II System

：TaqMan探针法。

实验例

操作方法

1. 稀释lDNA。

将lDNA按10的倍数稀释成0.5 fg/ml～500 pg/ml 的7个梯度浓度。

2. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行)。

3. 进行Real Time PCR反应。

用离心机轻轻离心PCR反应管后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应，进行Negative Control实验时的DNA模板使用了2 ml的灭菌蒸馏水，PCR反应条件如下：

4. 分析Real Time PCR扩增曲线。

5. 制作标准曲线。

反应结束后，由各扩增曲线得到的Ct值，制作标准曲线。

6. 结果分析。

以lDNA为模板，可以检测到1 fg的lDNA。由标准曲线可以看出，线性关系良好，在实验浓度范围内，可以得到非常正确的PCR定量结果。

进行RT-PCR反应时，使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）(TaKaRa Code：DRR061A）更为方便。PrimeScriptTM RT-PCR Kit由二部分组成，即：PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time)（TaKaRa Code：DRR037A）和Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)（TaKaRa Code：DRR039A，即本制品)。 这二部分试剂可以同时购买（TaKaRa Code：DRR061A)，也可以单独购买。

Protocol

进行RT-PCR反应时的实验例

操作方法

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制)。

使用TaKaRa Code：DRR037A的RT-Reagents试剂。

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。使用单引物

进行反转录时，使用量分别如下：

Random 6 mers (100 mM) 0.5 ml (50 pmol)

Oligo dT Primer (50 mM) 0.5 ml (25 pmol)

Specific Primer (2 mM) 0.5 ml (1 pmol)

*2 反应体积可按需求相应放大，10 ml的反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

2. 反转录反应条件如下：

*3 应用Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15min。使用基因特异性下游引物进行

反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时，将温度升到50℃会有所改善。

3. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

(使用Smart Cycler System时）

4. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 ml*4的RT反应液，

保证最终反应体积为25 ml。

*4 RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

5. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

：Human GAPDH

：HL60 Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液，其量相当于1 pg～100 ng

的Total RNA量。Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。

：130 bp

7. 结果分析。

本实验检测到了HL60 Total RNA 1 pg ~ 100 ng相当量的cDNA。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。