DRR037S

10 ml反应×100 次

1,000 元

DRR037A

10 ml反应×200 次

1,800 元

制品说明

本制品是Real Time RT-PCR用的最佳反转录反应试剂。使用具有较强延伸能力的PrimeScript RTase可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA。操作简单，适合进行高通量分析。进行2 Step Real Time RT-PCR反应时，与SYBR(R) Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）(TaKaRa Code: DRR041）或Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time)（TaKaRa Code: DRR039）配合使用，能进行高性能的基因表达分析。

特长

使用了具有较强延伸能力的PrimeScript RTase，可以在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。

含有Oligo dT Primer和Random 6 mers两种反转录引物，可根据实际情况区别使用。反转录反应可以使用Random 6 mers或Oligo dT Primer，也可以Oligo dT Primer和Random 6 mers同时使用。只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer作为反转录引物。

制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR)，将Total RNA或cDNA稀释至低浓度时也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

试剂盒原理

本制品利用反转录酶PrimeScript RTase将RNA反转录成cDNA，然后使用Real Time PCR 反应用试剂，如：本公司的Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time) (TaKaRa Code: DRR039）

或SYBR(R) Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time) (TaKaRa Code: DRR041）等，以合成的cDNA为模板，进行Real Time PCR反应，其原理图见图1。

Real Time PCR扩增反应可采用如图2显示的SYBR Green I嵌合荧光法或如图3显示的TaqMan探针法等。

图1 2 Step RT-PCR法原理图

● 嵌合荧光检测法

SYBR Green I与双链DNA结合后发出荧光，实验时可以实时监测反应体系中的SYBR Green I荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见图2。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光， 通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

图2 嵌合荧光法原理图

● TaqMan(R)探针法

TaqMan探针法是使用5' 端带有荧光物质（如：FAM等)，3' 端带有淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5' 端的荧光物质受到3' 端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5' 端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5' →3' Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见图3。

图3 TaqMan 探针法原理图

Application

本实验以Mouse Liver Total RNA为模板，使用2 Step Real Time RT-PCR方法，扩增Mouse GAPDH基因。实验时，首先以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA溶液使用EASY Dilution按10倍梯度稀释，再将相当于1 pg～100 ng Total RNA量的cDNA作为模板，进行Real Time PCR扩增（使用了SYBR Green I嵌合荧光法)， 制作标准曲线。具体实验过程如下：

【反转录反应】

以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应。

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制)。

Real Time RT-PCR反应验证实验

*1 Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用，可有效地将全长mRNA反转录成cDNA。

*2 反应体系可按需求相应放大，10 ml反应体系可最大使用500 ng的Total RNA。

2. 反转录反应条件如下：

: Mouse Liver Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液。

: Mouse GAPDH

使用EASY Dilution将cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀释 (10倍梯度稀释）后，各取2 ml进行Real Time PCR反应。此时25 ml PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于从100 ng，10 ng，1 ng，100 pg，10 pg，

1 pg的Total RNA反转录得到的cDNA量。

Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。

: 108 bp

: Smart Cycler System

: SYBR Green I嵌合荧光法

3. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

使用SYBR(R) Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time)（TaKaRa Code：DRR041）

4. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 ml的上述各cDNA的

梯度稀释液。cDNA梯度稀释液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V ）量。

5. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

6. Real Time PCR反应结果。

Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

7. 结果分析。

本实验检测到了Mouse Liver Total RNA 1 pg～100 ng相当量的cDNA。分析融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。