(Perfect Real Time)

DRR063S

50 ml反应×120 次

2,400 元

DRR063M

50 ml反应×200 次

3,000 元

DRR063A

50 ml反应×200 次

3,600 元

制品说明

本制品是采用SYBR(R) Green I嵌合荧光法进行Real Time RT-PCR的专用试剂。Real Time PCR方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本制品可以准确简便地进行mRNA的表达分析。

本制品由「A. 反转录反应试剂」(TaKaRa Code：DRR037）和「B. PCR反应试剂」(TaKaRa Code：DRR041）两部分构成。其「B. PCR反应试剂」部分已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP、SYBR Green I等试剂预混在一起，是一种2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。

「B. PCR反应试剂」制品中的PCR用DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS，并与TaKaRa精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。

本制品适合于Thermal Cycler DiceTM Real Time System、ABI PRISM 7000/7700/7900HT、7300/7500 Real-Time PCR System、7500 Fast Real-Time PCR System、LightCycler(R)、Line-Gene、Smart Cycler(R)、Mx3000P等各种机种的Real Time PCR扩增仪。试剂盒中还附带有ROX Reference Dye，可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。此外，本制品也适用于使用玻璃毛细管的Real Time PCR扩增仪，并且不需要再添加BSA。本制品还适合于快速Real Time PCR的扩增反应。

本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

适用的Real Time PCR扩增仪

Thermal Cycler DiceTM Real Time System (TaKaRa)

ABI PRISM7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems）

LightCycler(R)（Roche Diagnostics）

Line-Gene（Bioer，杭州博日）

Smart Cycler(R) System（Cepheid）

Mx3000P (Stratagene)

其他各种Real Time PCR扩增仪

Limited Use Label License: [M57], [L11], [L15], [P5]

试剂盒原理

本制品首先利用反转录酶PrimeScript RTase将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板利用TaKaRa Ex Taq HS进行Real Time PCR扩增反应（使用SYBR Green I嵌合荧光法)。

RT-PCR反应采用了如图1显示的2 Step RT-PCR方法。反转录反应以Total RNA为模板，以Random 6 mers或Oligo dT Primer，也可以Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用作为反转录引物，进行多基因的表达分析；如只扩增一种目的基因，也可以使用Specific Primer（Reverse）为反转录引物，合成cDNA。 然后以合成的cDNA为模板，以Specific Primer（Forward，Reverse）为引物，进行Real Time PCR扩增反应。

Real Time PCR扩增反应采用了如图2显示的SYBR Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。

特长

通过Real Time RT-PCR反应，可以快速、准确地对mRNA进行表达分析。

使用了具有较强延伸能力的PrimeScript RTase可以在较短的时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，是进行2 Step Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。

采用2 Step RT-PCR法，反转录反应时可以使用Random 6 mers或Oligo dT Primer，也可以Random 6 mers和Oligo dT Primer同时使用作为反转录引物。只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer作为反转录引物。

PCR用DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS，可以进行Hot Start法PCR反应， 再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。PCR反应试剂是2×浓度的Premix Type试剂，PCR反应液配制十分简单方便。

制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR)，将Total RNA或cDNA稀释至低浓度也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

Application

本实验以Mouse Liver Total RNA为模板，使用2 Step Real Time RT-PCR方法，扩增Mouse GAPDH基因。实验时，首先以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应，然后将得到的cDNA溶液用EASY Dilution按10倍梯度稀释，再将相当于1 pg～100 ng Total RNA量的cDNA作为模板，进行Real Time PCR扩增（使用了SYBR Green I嵌合荧光法)，制作标准曲线。具体实验过程如下：

【反转录反应】

使用本制品的「A. 反转录反应试剂」(TaKaRa Code：DRR037A)。

以Mouse Liver Total RNA为模板进行反转录反应。

1. 按下列组份配制RT反应液（反应液请在冰上配制)。

实验例

2. 反转录反应条件如下：

：Mouse GAPDH

：Mouse Liver Total RNA经反转录反应后的cDNA溶液。

使用EASY Dilution将cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀释(10倍梯度稀释）后，各取2 ml进行Real Time PCR反应。此时25 ml PCR反应液中的cDNA添加量分别相当于从100 ng，10 ng，1 ng，100 pg，

10 pg，1 pg的Total RNA反转录得到的cDNA量。

Negative Control时的模板使用了灭菌蒸馏水。

：108 bp

：Smart Cycler System

3. 按下列组份配制PCR反应液（反应液请在冰上配制)。

4. 将上述PCR反应液加入Real Time PCR用反应管中，然后再加入2 ml*的上述各cDNA的

梯度稀释液。

* RT反应液的加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。

5. 进行Real Time PCR反应，PCR反应条件如下：

6. Real Time PCR反应结果。

Real Time PCR扩增曲线图及融解曲线图如下：

反应结束后，根据扩增曲线的2nd derivative得到各扩增曲线的Ct值，制作标准曲线。

7. 结果分析。

本实验检测到了Mouse Liver Total RNA 1 pg～100 ng相当量的cDNA。分析融解曲线可知，无论哪一种浓度的模板都能够得到单一的PCR扩增产物。同时标准曲线的线性关系良好，在实验浓度范围内能够进行准确定量。