Fungi Identification PCR Kit

D317

50 次

800 元

制品说明

本试剂盒是利用分子生物学手段进行真菌菌种鉴定的试剂盒。使用试剂盒中的引物，PCR扩增未知真菌的26S rDNA D1/ D2区域或ITS全序列（包括ITS1、5.8S rDNA、ITS2），经测序后与GenBank中已知的序列进行同源性比较，可以对未知菌种进行鉴定。

真菌的传统鉴定方法主要以细胞的表型特征为依据，包括细胞形态、生理、生化等方面。

传统鉴定方法比较费时、费力，而且有时不够准确，例如有些真菌的有性生殖阶段与无性生殖阶段的形态特征差别很大，难以从表观特征上加以区分，使传统的鉴定方法受到限制。近年来发展起来的26S rDNA D1/ D2区序列及内转录间隔区ITS (Internal Transcribed Spacer) 序列分析技术，克服了传统鉴定方法中的诸多不足，能够快速、准确地对真菌进行鉴定，为建立一个符合客观实际的自然分类系统奠定了基础。

真菌基因组中编码核糖体的基因包括4种，26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。真菌的26S rDNA，

可分为D1、D2、D12等多个区域，其中D1/ D2区域序列长度为500~600 bp左右，可用于真菌鉴定。几乎所有已知酵母菌种模式菌株的D1/ D2区序列都已被测定。真菌的ITS，包括ITS1及ITS2两部分，全长在300~1,000 bp左右，进化速度快，具有多态性，对于亲缘关系较近的菌株的区分鉴定较适合。使用本试剂盒可将未知真菌鉴定到属或种。

本试剂盒提供了PCR扩增真菌26S rDNA D1/ D2区序列及ITS全序列的所有试剂，同时还提供了一对测序引物（正向测序引物Seq Forward Primer，反向测序引物Seq Reverse Primer)。试剂盒中的Positive Control DNA可以进行Control实验，用于检测试剂盒的PCR扩增性能，判断PCR反应是否正常进行等。

本试剂盒可以对绝大多数真菌进行鉴定，特别适用于那些难以培养的真菌及传统表型方法鉴定困难的真菌。

测序用引物序列

操作方法

1. 模板DNA的提取。

实验所需的真菌基因组DNA可通过试剂盒（如：TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa Code: DV811A)）提取，也可通过液氮研磨或真菌溶壁酶处理后，使用传统的酚-氯仿抽提法提取。

2. PCR反应。

① 按下列组份配制PCR反应液。

Protocol

*1 负对照：使用1 ml dH2O替代模板DNA作为PCR反应的模板。

正对照：使用1 ml Positive Control DNA作为PCR反应的模板。

*2 26S rDNA D1/D2区扩增：使用D1/D2 Forward Primer和D1/D2 Reverse Primer。

ITS区扩增：使用ITS Forward Primer和ITS Reverse Primer。

② PCR反应条件如下：

3. PCR产物的电泳。

进行1%~3%的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物的长度因菌种不同而异，一般26S rDNA D1/D2区长度约为500~600 bp，ITS区全长为300~1,000 bp不等。

Positive Control DNA扩增片段大小：使用D1/D2 Forward Primer和D1/D2 Reverse Primer时，扩增片段为407 bp；使用ITS Forward Primer和ITS Reverse Primer时，扩增片段为433 bp。

4. PCR产物的回收及DNA测序。

使用凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code: DV805A; D301等）回收纯化PCR扩增产物，然后进行DNA测序，回收产物可用Seq Forward Primer或Seq Reverse Primer进行DNA测序。

5. 菌种鉴定。

将DNA测序结果与相应的数据库（如NCBI）进行比对，确定菌种种类。

Application

使用本试剂盒对球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)、银耳 (Tremella fuciformis)、深红酵母 (Rhodotorula rubr) 进行了26S rDNA D1/D2区序列及ITS全序列的PCR扩增。然后使用了1%的琼脂糖凝胶进行电泳，结果见下图：

实验例

TaKaRa公司已经验证菌种一览表