pMD20-T Vector

D107A

1.0 mg

800 元

D107B (A×5)

5.0 mg

3,400 元

D107C (A×10)

10.0 mg

6,400 元

制品说明

pMD20-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。本载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I 和BamH I 位点之间增加了Spe I、Nde I、EcoR V 三种酶切位点，经EcoR V酶切后再在两侧的3' 端添加“T”制备而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3' 端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

本载体在pUC19载体的基础上对Lac Z基因的编码序列进行了改造，大大降低了假阳性率， 加强了蓝色菌落在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上的显色效果，提高了阳性克隆的筛选成功率。由于在Lac Z基因编码区上游插入了SP6 Promoter，因此可以对插入DNA片段直接进行体外转录实验。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert (500 bp) 可以用于Control反应。

纯度

Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

Control Insert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T碱基的存在。

用途

进行TA克隆，克隆PCR产物。

使用SP6 RNA Polymerase对克隆体进行体外转录。

对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

pMD20-T Vector相关位点说明

操作方法

Control DNA片段的克隆实验

加入5 ml（等量）的 Solution I。

16℃反应30分钟。

注 ①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低。

全量（10 ml）加入至100 ml JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

加入890 ml SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、 蓝色菌落。

挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

结果

使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：

1.5×108 cfu/mg pUC19 DNA。

* 效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率。

问答

怎样提高连接转化效率？

1. 确认Insert DNA片段的3' 末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶

(如：TaKaRa PrimeSTAR HS、TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu等)扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。

2. 纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片

段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用TaKaRa凝胶回收试剂盒 (TaKaRa Code：D301或DV805A)。

3. 请使用转化效率大于108 cfu/mg pUC19 DNA的感受态细胞。

4. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段

DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。

5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。

6. Solution I应尽量避免反复冻融。

7. 建议使用新配制的平板培养基。

转化后的菌落全为蓝色，但有目的DNA片段的插入，为什么？

插入的DNA片段较短(小于500 bp)，且插入片段没有影响LacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色)。

欲对克隆DNA片段进行测序时，使用何种引物？

本载体来源于pUC19载体。因此，用于pUC19载体测序的通用引物都可以使用。