D105A

1.0 mg

300 元

D105B (A×5)

5.0 mg

1,275 元

D105C (A×10)

10.0 mg

2,400 元

D106A

1.0 mg

300 元

D106B (A×5)

5.0 mg

1,275 元

D106C (A×10)

10.0 mg

2,400 元

制品说明

pSIMPLE-18 EcoR V/BAP、pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector是一种高效克隆末端平滑PCR产物的专用载体。这两种载体是分别由pUC18、pUC19载体改建而成，它消除了pUC18、pUC19载体上的多克隆酶切位点，再在多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V将其切成末端平滑的线性DNA后，进行了5'末端的去磷酸化处理，以避免克隆DNA片段时产生大量载体自连现象。

这两种载体尽管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位点，但不影响 b-半乳糖苷酶的正常表达，PCR扩增片段克隆于载体后仍可以利用a-互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性克隆。

有很多高保真DNA聚合酶，如：TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu等，其扩增的DNA片段为平滑末端，可以方便使用这两种载体进行DNA克隆。由于这两种载体的5'末端进行了去磷酸化处理，如果PCR扩增片段的5'末端不带磷酸基团时，应对其进行5'末端磷酸化 (可使用TaKaRa DNA Kination Kit，TaKaRa Code：D402) 处理后再使用载体进行DNA克

隆。由于这两种载体上消除了多克隆酶切位点，当PCR产物使用这两种载体进行DNA克隆时，将无法使用载体上的限制酶切下， 需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。

由于这两种载体是分别以pUC18、pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18、pUC19载体相同的功能。此外，这两种制品中的高效连接液Ligation Mix可以在极短时间内 (约5分钟) 完成连接反应，且此连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。制品中的Control Insert 2 (500 bp) 还可以用于Control反应。

pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector 与pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector 相比，pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector的b-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

这两种载体同样可以用于末端平滑的其他DNA片段的克隆。

纯度

Control Insert 2经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

用途

平滑末端PCR产物的克隆。

其他平滑末端DNA片段的克隆。

对克隆后的DNA片段使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector相关位点说明

pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector相关位点说明

Protocol

操作方法

Control DNA片段的克隆实验

在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 ml。

1.

加入5 ml（等量）的 Ligation Mix。

16℃反应30分钟。

注 ①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

全量（10 ml）加入至100 ml JM109感受态细胞中冰中放置30分钟。

42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

加入890 ml SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、 蓝色菌落。

挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

注: 此时也可以提取质粒，然后经EcoR V酶切鉴定插入DNA片段。

结果

使用Control Insert 2时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：3×108 cfu/mg pUC19 DNA。

* 效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的插入效率。