TaKaRa的基因解析中心拥有60多位专业技术人员，拥有多台ABI377、MegaBACE1000、ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer DNA测序仪，每天可进行20,000多个测序反应。欢迎惠顾TaKaRa DNA测序服务。

【各种服务价格表】

测序样品的提供

质粒DNA的测序

Sample形态为提纯质粒时

请注明载体名称及结构情况、插入片段的长度及插入片段的酶切位点等情况，请提供3 ~ 5 mg提纯的质粒DNA (浓度大于200 ng/ml)。如果提供质粒偏少需要公司转化时，收取质粒转化费用。

Sample形态为含有质粒的菌体时

请注明菌体的种类及抗生素抗性的情况、所含载体的名称及结构情况、插入片段的长度及插入片段的酶切位点等情况。对于一般的质粒，本公司免费提纯质粒后进行DNA测序。如果提供的菌体需特殊培养，或质粒的拷贝数较低时，需收取质粒纯化费，收费标准视具体情况而定。

PCR产物直接测序

Sample形态为纯化后的PCR产物时

请提供切胶回收纯化后的PCR产物1 ~ 3 mg (浓度大于100 ng/ml), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/ml的测序引物20 ml以上。此外，请注明PCR产物的长度、引物的具体序列等情况。

Sample形态为未纯化的PCR产物时

请提供5 ~ 20 mg的粗PCR产物, 我们负责纯化测序 (收取纯化费)。同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/ml的测序引物20 ml以上, 并请注明PCR产物的长度、引物的具体序列等情况。

Sample形态为PCR模板DNA时

请提供适量的模板DNA及用于PCR的引物 (浓度大于3.2 pmol/ml约100 ml)。本公司负责PCR反应和PCR产物的纯化及测序 (需收取PCR反应费及PCR产物的纯化费) 。此外，请注明PCR产物的长度及引物的具体序列等情况。

注意事项

PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡切胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开，此时的PCR产物便无法直接测序。这种情况建议把PCR产物克隆后测序。

PCR产物直接测序成功的另一要因是引物，不是能做PCR反应的引物便能测序。测序用引物要求较高,引物的3'端必须与模板完全匹配，含有Mix碱基的引物一般不能测序 (特别是3'端)。此外，测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50 ~ 60%左右。而且，用于测序的引物一定要纯，纯度必须大于90%。

在PCR扩增时，难以扩增（扩增后的PCR带较弱）的PCR产物在测序时一般成功率较低。

小于150 bp的PCR产物直接测序效果不好，请克隆后测序。

Cosmid中插入DNA片段的测序

请提供纯化后的Cosmid DNA大于5 mg (因每个反应的用量需1 mg以上)。DNA必须注明浓度，并请提供浓度 (浓度须正确) 大于5 pmol/ml的引物10 ml以上。此时每个反应的收费标准为500 元。

其他说明

客户在提供测序样品的同时，请注明用何种引物，测几个反应，是否测通，是单链测序 (Single strand reading)，还是双链测序(Double strands reading) 等。

测序用引物的说明

客户自备引物的说明

提供引物的序列，需要我们合成时，按DNA合成服务收费。

自备引物时，请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/ml的引物20 ml以上，并注明引物序列。

注意引物长度宜在20个碱基左右，GC含量在50 ~ 60%左右。不要使用含有Mix碱基的引物，特别在3'端的3个碱基内不能含有Mix碱基。

引物纯度必须大于90%。

本公司免费提供的测序用引物

M13(+), M13(-), T7 promoter, T7 terminator, T3 promoter, SP6 promoter, pGEX 3'P, pGEX 5'P, pBV220 3'P, pBV220 5'P, AOX 3'P, AOX 5'P, BGH rev., PCIT7, pACT2-F, pACT2-R,pCMV-F, pCMV-R, pGAD3'P, pLXSN-F, pLXSN-R, pQE30PF, pQE30PR, pEGFP-CF, pEGFP-CR, pEGFP-NF, pEGFP-NR等

测序结果说明

测序结果

测序完成后，我们用E-mail给客户发送序列和彩图，并用EMS提供以下资料：对每个Sample提供一份测序报告,其中有测序操作情况, 测序方向图 (同一样品进行两个以上反应时), 常用酶切位点图, 测出的具体序列图, 彩色波形图等。同时给一次性进行10个以上测序反应的客户提供光盘。

光盘中包含有Chromas软件 (附使用说明)，TEXT文件的测序结果，ABI文件或SCF文件的测序图谱等。

一个正常的成功反应，能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 ~ 800 Bases)。

在进行DNA测序时，紧接引物的10 ~ 30 Bases有时不一定能完全读清楚。

由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：G/C rich; G/C Cluster；Poly A、 Poly T的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。

以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。出现以上情况后，我们提倡从另一方向进行测序。

备注说明

一般正常的质粒从收到样品日至发货日时间为三天。如果Sample形态为菌体或样品需要转化时，应多加 2天时间。对于三个工作日内无法得到测序结果的，我们会用E-mail或电话、传真等及时与客户或代理商联系。

并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的，我们会尽力找到可能的原因，以建议进一步如何操作。

大片段DNA的测序

鸟枪法 (Shot Gun Sequencing) 测序

鸟枪法测序的操作方法

●

用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。

对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化。

进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。

把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。

对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。

对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

DNA测序量

应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的4倍量进行计算，对每个反应的有效测序长度定义为400 Bases。

如：对10 kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：

测序量＝10,000 Bases×4/400 Bases＝100个反应

结果编辑

按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段 (Contig)。

补缺工作

结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段 (Contig) 间的序列没有测定，此时应该进一步通过技术手段，解析那些没有被解明的DNA序列，进行整体DNA序列的补缺工作。

收费标准

DNA文库构建费用：3,000 元/文库。

DNA测序费用见下表

1.

2.

补缺费用：1 元/Base (含DNA测序费、引物合成费、克隆费、PCR反应费等)。

合计费用：上述的1+2+3的总计费用为鸟枪法测序的合计费用。

3.

其他说明

●

1.

2.

病毒DNA中，特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现，可能无法测序，请理解。

DNA序列中，有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现，此部分有可能无法测序，请理解。

限制酶切，亚克隆测序法

测序方法

由于鸟枪法测序会出现较多的重复测序结果，因此，小于100 kbp的DNA片段测序工作使用鸟枪法测序价格太昂贵，此时比较适合于使用限制酶切、亚克隆测序法。

限制酶切、亚克隆测序法的方法如下：

1.

2.

3.

4.

5.

选择适当的限制酶，对Insert DNA片段进行切断处理。

对切断的DNA片段进行亚克隆。

对每个亚克隆中的DNA片段进行测序。

编辑测序结果。

整体序列如有空缺，进行补缺工作。

收费标准

0.8元/Base (含DNA测序费、引物合成费、克隆费、PCR反应费等)。

其他说明

1.

2.

病毒DNA中，特别是病毒DNA的两端经常会有大片段的DNA重复序列出现，可能无法测序，请理解。

DNA序列中，有时会有G、A、C、T的连续结构、G/C rich等复杂的立体结构出现，此部分有可能无法测序，请理解。

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