N-3.FH11

问答

DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?

溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小，但根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好?

我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。

如果您可以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够，我们就需要对质粒进行转化，此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好，象TaKaRa、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。

提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序样品的提供”部分的说明。

提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好?

一般，菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。

平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。

制作穿刺菌时，可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

测序结果有很多套峰（出现很多N)，还照常收费，为什么?

DNA模板上出现二处以上的引物结合位点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象（见图4)。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物（限非TaKaRa合成的引物）本身所造成，对这些结果（公司保证进行2次以上的测序工作)，公司会根据具体情况进行收费（详细见测序结果说明)。

为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象?

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测序结果不到500 Bases，还照常收费了，为什么?

如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到500 Bases以上。

但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成（公司保证进行2次以上的测序工作)。对这些结果，公司会根据具体测序情况，进行收费（详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下：

● G/C rich、G/C Cluster。这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失（见图1)。

● A、T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰（见图2)。根据文献

记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应（打滑现象)，造成测序结果紊乱，出现套峰。

一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰，但有时60～70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。

一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应（测序反应本身也是PCR反应）二次聚合酶的打滑现象。

● 原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异

常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行（见图3)。

为什么在测序结果上找不到测序引物的序列?

目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记，测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列，因为引物本身是不做荧光标记的，所测序列是从引物3'末端后第一个碱基开始的，所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物，要想得到PCR引物的序列，可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上，用载体上的引物（注意此引物也不能离插入片段太近）测序。

在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么?

由于测序仪自身缺陷，紧接引物之后的测序结果信号较弱，一般在测序用引物后面几个至数十个（严重时40～50个）碱基会读不出来（或者读错)，请引起注意。

怎样使用TaKaRa提供的测序报告?

在我们提供的测序报告中，有一份打印的（并用E-mail提供）DNA碱基排列顺序的测序结果。这个结果是我们根据测序仪的自动分析结果，并经严格确认后打印（并用E-mail提供）的测序结果。但测序仪有时会发生误读或漏读现象，而我们的工作人员在检查时也没有发现，这时的打印结果（并用E-mail提供）会出现错误。只有原始的测序彩色波形图才是最正确的，请客户拿到结果后，进行详细确认。如有不明白的地方，请立即和我们联系，我们会随时确认并进行解决。

PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?

众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶 (详细请阅读TaKaRa商品目录的「一般PCR相关制品」部分)。