细菌16S rDNA菌种

鉴定

细菌的rRNA有5S，16S，23S三种。其中5S rRNA信息量少，不适合分析，而23S rRNA分子量大，但碱基突变速率要比16S rRNA快得多，对于较远的亲缘关系不适用。16S rRNA其大小在1500 bp左右，所代表的信息量适中，因此是进行分类研究的理想材料。

我们使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (TaKaRa Code: D310) 进行实验。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因，并进行DNA测序，与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。

服务内容

● 细菌16S rDNA部分序列解析

扩增细菌16S rRNA前500 bp的片段，只需进行一个测序反应，即可得到含有部分种属特异性的16S信息，是一种较为经济便捷的鉴定方法。

● 细菌16S rDNA全序列解析

扩增细菌16S rRNA的全长序列，约1500 bp左右，需进行三个测序反应，以得到较为全面的种属特异性信息。

服务说明

1. 我们目前接收的样品形式为：基因组DNA、带有单菌落的平板或斜面。由于用平板和斜面以外的其它培

养基时实验成功率较低，所以我们暂不接收这样的样品。

2. 基因组DNA的浓度不低于10 ng/�ml，总体积不少于20 �ml。平板或斜面应长有至少分离三次以上的单菌落。

3. 由于革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，采用试剂盒常规方法较难破壁，建议您最好提供基因组DNA。

4. 如果因实验样品不纯造成的测序套峰，本公司将收取全额实验费用。

价格·实验周期

以上实验费用及周期是针对正常实验样品制定的，样品特殊或样品多时除外。

提供结果

实验报告（包括PCR产物照片、菌种鉴定NCBI参考结果等)、测序彩色波形图、测序方向图、序列碱基图、保存电子版结果的CD光盘。

如果您需要进行此项服务,请填写“微生物菌种鉴定服务委托书”。您可以在本商品目录的Q-19页或网站下载获得表格,填写后通过传真或E-mail发送给我们或当地代理商。

扩增不出的原因主要有以下几种：

① 您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌。

② 您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁。

③ 培养基或菌体中的表达产物含有抑制PCR反应的组份。

好的样品是实验成功的保障，所以：

① 建议您在提供给我们材料之前做一下初步鉴定，确定其为革兰氏阴性细菌还是革兰氏阳性细菌；

如果为革兰氏阳性细菌，您最好提供给我们基因组DNA。

② 菌种单一是实验成功的关键。建议您在提供给我们菌体样品之前最好做三次以上的划线分离，并且

分离后能分辨出单菌落；对于基因组DNA也一定要使用经分离后的菌体所提取的DNA。

③ 如果您选用的特殊培养基成份中含有能抑制PCR反应的成份，建议您能够提供给我们该细菌的基因

组DNA。

④ 常温运输时间过长会导致菌体老化，细胞壁难以破碎，建议您根据菌体的生长周期考虑是否应该使

用冰袋运输。

为什么测序彩图有时会有套峰？

造成套峰的情况有以下几种：

① 测序结果个别碱基读N，是由细菌rDNA多态性造成，对细菌菌种鉴定无影响（见图1）。

（图1）

② 使用Seq Reverse（或Seq Forward）测序，在连续几个相同的碱基后开始出现严重套峰，这也是由

细菌rDNA多态性造成的。我们在中间序列设计16S Seq F（或16S Seq R）引物进行反向测序后，

该处套峰消失（见图2）。

（图2）

③ 所有测序反应均出现大面积套峰（见图3），是由于客户提供的样品模板不纯造成的。这种情况需

要重新分离纯化菌种或将PCR产物克隆测序。

（图3）

真菌26S rDNA D1/D2

区及ITS区菌种鉴定

真菌基因组中编码核糖体RNA的基因有4种，26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。真菌大亚基上的26S rDNA分子，可分为D1、D2…D12等多个区域，其中D1/D2区域序列长度适中，适合于真菌鉴定。

真菌的ITS (Internal Transcribed Space) 基因，包括ITS1及ITS2两部分，进化速度快，具有多态性，适于对亲缘关系较近的菌株进行区分鉴定。

我们使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit (TaKaRa Code: D317) 进行实验。利用rDNA的保守序列设计引物，PCR扩增未知真菌的26S rDNA D1/D2区或ITS区，测序后与GenBank中已知的序列进行同源性比较，将未知真菌鉴定到属或种。

服务内容

● 真菌26S rDNA D1/D2区序列解析

PCR扩增真菌26S rDNA D1/D2区片段，长度在500~600 bp左右，只需进行一个测序反应*，即可得到26S rDNA D1/D2区序列信息。该方法尤为适合对酵母菌进行鉴定。

● 真菌ITS区(包括ITS1、5.8S rDNA、ITS2) 全序列解析

PCR扩增真菌ITS区片段，长度在300~1000 bp左右，依据PCR扩增片段的长度，进行一个或两个测序反应*，即可得到ITS区全序列信息。

* 对于某些真菌，其26S rDNA D1/D2区或ITS区结构复杂，进行一个方向的测序往往不能得到全序列，需要同时进行

反方向的序列测定。

服务说明

1. 目前我们接收的样品形式为：

● 基因组DNA：样品浓度不低于10 ng/�ml，总体积不少于20 �ml。

● 丝状真菌：液体培养的菌丝，菌丝要保证新鲜，且经过分纯无其它菌体污染。

● 酵母类真菌：斜面或平板形式的新鲜单菌落，且至少经过三次以上划线分离。

2. 对于某些真菌，使用试剂盒常规方法破壁困难，建议您最好提供基因组DNA。

3. 如果因实验样品不纯造成的测序套峰，本公司将收取全额实验费用。

价格·实验周期

以上实验费用及周期是针对正常实验样品制定的，样品特殊或样品多时除外。

提供结果

实验报告（包括PCR产物照片、菌种鉴定NCBI参考结果等)、测序彩色波形图、测序方向图、序列碱基图、保存电子版结果的CD光盘。

如果您需要进行此项服务,请填写“真菌26S / ITS菌种鉴定服务委托书”。您可以在本商品目录的Q-20页或网站下载获得表格,填写后通过传真或E-mail发送给我们或当地代理商。