MegasortTM技术是用于分离解析两种样品之间具有表达差异基因的技术。把两种细胞来源的基因，用不同的荧光物质进行标记，在利用MegasortTM技术得到的微粒上进行竞争性杂交反应后，再用细胞分选仪 (Cell sorter）进行分离。MegasortTM技术不受样品的种类、序列情况的有无、基因是否已知等情况的限制,可以解析到样品中几乎所有的差异基因。MegasortTM技术可以解析到cDNA序列3' 末端的数百个碱基的序列情况，即使在能解析的样品基因序列背景信息很少的情况下，也可以通过和其它同源物种的基因序列比较来解析其功能。由于通过此技术解析得到的cDNA全部是有表达差异的基因（即功能性基因)，如果利用这些cDNA做成DNA芯片，可排除无表达差异基因的干扰，高效地进行功能基因的解析。与其他传统的分离差异基因的技术相比，MegasortTM具有灵敏度高、覆盖率全、假阳性率低等优点。MegasortTM通过一次实验就可以分离出两种样品间几乎所有表达有差异的基因，对于表达差异较小或自身丰度较低的基因极为有效，这些优点都是DDRT-PCR、差减杂交等技术无法比拟的。

服务内容

1. Megaclone beads的制备

1) 接收两种RNA样品。

2) Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品的质量。

3) 各RNA通过运用Unilength技术将片段克隆至Tag Vector制备成Tag文库。

4) 将每个样品的Tag文库制作成约500,000个Megaclone beads。

2. Megasort

1) 制作探针

取两种样品的RNA各10 mg，使用带有T7启动子的Oligo dT Primer将RNA反转录成cDNA。以得到的双链cDNA为模板添加Fluorescein-UTP或Cy5-UTP，使用T7 RNA Polymerase进行in vitro transcription反应, 制作荧光标记RNA探针。

2) Gate设定用解析

把两种样品制备而来的Megaclone Microbeads各约40万个混合，之后加入相应标记了不同荧光物质的探针进行过夜杂交。

把杂交得到的Megaclone Microbeads使用CellSorter（MoFlo，DakoCytomation公司）解析，解析用的各图谱是利用标记于Beads上的信号所产生的各种参数所得到的。

根据解析结果做成Gate设定解析报告书，并与客户商谈划分的Gate设定。

3) PCR扩增

把经过分离得到的Megaclone Microbeads以每200个为一个单位进行分装，分装至96 Well PCR扩增板中，对插入的cDNA片段进行PCR扩增。每个Gate最多分装一个96 Well PCR扩增板（每Well中200个Beads)，超出部分以5,000个Beads为单位分装后进行PCR扩增。

4) 克隆测序

1个Gate取1个PCR扩增Well（相当于约200个beads）的PCR产物进行克隆，再选取192个克隆进行One pass DNA测序（2个Gate共选取384个克隆进行测序）。

测序数据使用Base caller（Phred，Codon Code公司）变换成序列，从中计算出表示各碱基可信度的Phred值。Phred值在15以上的碱基超过300个时此克隆有效。有效克隆数达到70%以上（192中有135个以上）为合格。

2. BLAST 同源性检索

1) Phred值在15以上的测序数据经Clustering处理后，在NCBI核酸序列数据库中进行BLAST同源搜索。

2) 解析结果刻录在CD光盘上。

服务说明

Megasort分析是比较两种样品之间的表达差异，每种样品至少需要100 mg Total RNA或2.5 mg以上的

poly(A)+ RNA。

解析种类的选择

* Megasort FAST为2种样品混合后制作共计50万个Beads。

价格·实验周期

* 根据样品数和选择性等价格与供货期各异，详情请垂询。

提供结果

● 客户服务报告

● PCR扩增产物

PCR扩增产物的96 well平板返还，每个Gate超出96 well的Beads的PCR扩增产物（每个Tube中相当于

5,000个beads的PCR扩增产物）返还。

● 数据CD光盘

包含测序数据经BLAST搜索的结果。