TaKaRa DNA、RNA合成服务
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本章内容
    

近年，随着DNA重组技术及PCR扩增技术的蓬勃发展，人工合成Oligo DNA的需求量越来越大，已经成为了分子生物学实验中最基础的试剂之一。而合成Oligo DNA的质量，直接影响着科研人员的实验计划的顺利进行。因此，使用高质量的合成DNA制品变得尤为重要。
TaKaRa以高质量的产品和完善的服务赢得了良好的国际声誉。TaKaRa的DNA合成中心拥有50多位专业技术人员，每天为国际、国内市场提供1,000多条合成DNA制品。今后，我们还会一如既往地努力维护良好的公司信誉，不断为客户提供高质量的产品，并进一步完善售后服务工作。

■TaKaRa合成Oligo DNA制品有如下特点：

  • 高质量合成。使用进口合成试剂，努力生产高质量制品。

  • 高纯度纯化。推出普通级（OPC纯化)、PAGE级（PAGE纯化)、高纯度级（HPLC纯化）等制品，供客户按实验需要进行选择。各种纯化法均使用进口试剂及仪器进行操作，以提高制品纯度。并对制品进行严格的监控，保证万无一失。

  • 制品速溶性。所有的合成DNA制品均使用冻结干燥法成形制品。客户能直观看到白色絮状物，在溶液中即刻溶解。现在，大多数公司采用离心真空干燥法成形制品，制品全部干燥于Tube管底部，无法直观看到，溶解时须激烈搅拌，除操作不便外，合成DNA制品也容易降解。

  • 高速度发货。保证当天的制品当天合成，普通级制品（OPC纯化）三天内发货。

  • 完善的数据。制品包装中附有制品的全套数据。如：DNA合成的原始数据，A、G、C、T各碱基的分布情况, 制品的分子量大小，制品的OD数、nmol数等等，使用方便。

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DNA合成的原理
Oligo DNA的人工化学合成是从1950年以后开始兴起的。随着科学技术的进步，DNA合成仪的完善，现在一般都采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行Oligo DNA的合成。Oligo DNA合成是由3'→5'进行合成的，一般3'的第一个碱基结合在Glass担体（Controlled Pore Glass，CPG）上。具体方法见图1，简要说明如下。

  1. Step1：对在CPG担体上附加的第一个碱基进行脱保护（DMTr基）反应，用以准备附加下一个新的碱基。

  2. Step2：活化新的碱基，准备和前一个碱基进行反应。

  3. Step3：第二个碱基附加反应到第一个碱基上。

  4. Step4：把第一个碱基没有和第二个碱基反应上的部分（反应失败部分）加帽封死（Capping反应)，不让其进行进一步延伸反应。

  5. Step5：对第二个碱基和第一个碱基的连接部分进行氧化反应，使3价磷变成5价磷，使合成产物变得更加稳定。

  6. 如需进一步合成延伸碱基时，再回到Step1进行合成。如此循环往复，可以不断合成DNA碱基，直至合成完所需序列。

  7. DNA合成结束后，进行Step6操作。从CPG担体上用氨水切离合成终了的Oligo DNA。

DNA制品的纯化


从DNA合成原理可知，Oligo DNA的合成是碱基和碱基之间通过化学反应连接而成的，而此时的化学反应效率一般称在99%左右，也就是说，在每次进行附加反应时，都会有总量的1%的DNA片段上附加不上新的碱基(出现合成失败DNA片段)，而这些合成失败的DNA片段全部残留在合成DNA粗制品中。如果使用合成DNA粗制品进行PCR反应、测序反应时，便会影响实验结果。
一般，粗制品中的目的DNA序列和失败DNA序列的比例大致如下表。
合成DNA长度 目的DNA比例（%） 失败DNA比例（%）
20 mer 83 17
50 mer 61 39
75 mer 48 52
100 mer 37 63

这些值是假设每次附加反应时的效率为99%时计算出的近似值，如果进一步考虑其他因素，那上表中的失败DNA的比例会进一步增大。因此，合成DNA的纯化是非常重要的。下面介绍一下TaKaRa公司的合成DNA制品种类以及DNA的纯化方法。

■TaKaRa合成DNA制品级别分类
TaKaRa共有三种级别的合成DNA制品，即：普通级、PAGE级、高纯度级。您可以按照您的实验需要选择合成适当级别的DNA制品。

  • 普通级制品：进行OPC纯化，纯度大于95%。适用于PCR用引物、DNA测序用引物、各种探针等。此级别只接受30mer以下的制品。

  • PAGE级制品：用PAGE胶纯化，纯度大于95%。适用于PCR用引物、DNA测序用引物、各种探针等。纯化21mer以上的合成DNA制品时，纯度高于OPC纯化法；纯化55mer以上的合成DNA制品时，纯度略高于HPLC纯化法。PAGE纯化法对长链DNA的纯化特别有效。

  • 高纯度级制品：采用高效液相色谱（HPLC）法进行纯化，纯度大于99%。由于纯度极高，使用本法纯化的DNA制品可适合于各种基因工程实验。特别是：PCR克隆、定点突变、人工合成基因等。

各种纯化方法的纯度比较如下:

DNA长度 纯度比较情况

备注

20mer以下 OPC≈PAGE＜HPLC 短链DNA PAGE纯化效果不太好
21mer～30mer OPC≤PAGE＜HPLC 　
31mer～45mer PAGE＜HPLC 31mer以上无OPC纯化
45mer以上 PAGE≥HPLC 31mer以上无OPC纯化

■各种合成DNA制品的纯化方法

  • OPC纯化
    OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反相层析柱（美国Waters公司生产)，根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%，具体操作方法如下。

  1. DNA合成是用全自动DNA合成仪从3'→5'进行人工合成的。在刚合成完的DNA的5'端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团DMTr基，而中间产物的短链杂质DNA中不具有DMTr基。利用这一性质进行目的DNA的纯化。

  2. 把粗样DNA加入Sep-Pak Cartridge柱上（简易反相柱)。此时，所有的合成产物全吸附于反相柱上。

  3. 用甲醇清洗反相柱。此时，吸附能力强的带有DMTr保护基的目的DNA仍吸附于反相柱上，而短链杂质DNA片段全部被冲走。

  4. 向反相柱上加入强酸TFA (Trifluoroacetic acid), 切断DMTr保护基和目的DNA之间的连接。

  5. 再用乙腈洗脱目的DNA。此时回收出来的目的DNA的纯度能达到95%以上 ,(图):
    。可用于DNA测序等。

  • PAGE纯化
    PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer）的纯化特别有效。

  • HPLC纯化
    HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。HPLC纯化的设备投资大，生产成本高，但使用本法纯化的DNA片段纯度极高，大于99%。HPLC纯化的操作方法如下。

  1. 合成高纯度级DNA制品时，在全自动DNA合成仪上，需自动脱去DMTr保护基。

  2. 将粗样DNA注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认粗样DNA的纯度，主峰位置等 (图):

  3. 增加注样量，回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链DNA，纯化目的DNA的目的(图)。为了确保DNA的纯度，一般一次的纯化量为1 OD左右。

  4. 把回收完后的DNA进行DNA纯度检测，确认纯度的可靠性(图)
    。

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TAKARA DNA 合成制品


TaKaRa DNA合成中心提供三种级别的合成DNA制品，即：普通级、PAGE级、高纯度级。您可以按照您的实验需要选择合适的合成DNA制品。此外，我们还提供多种（共60多种）合成DNA的修饰、标记制品。

■制品形态
冻结干燥品，呈白色絮状物。在溶液中即刻溶解，便于使用。

■制品价格、交货期

  • 一般DNA的合成价格:

链长* 级别 DNA量 价格 交货期
30mer以下 普通级 5 OD以上 6 元/Base 三天
PAGE级 2 OD以上 6 元/Base 四天
高纯度级 1 OD以上 15 元/Base 四天
31mer～40mer PAGE级 2 OD以上 6 元/Base 四天
高纯度级 1 OD以上 15 元/Base 四天
41mer～70mer PAGE级 2 OD以上 10 元/Base 五天
高纯度级 0.5 OD以上 20 元/Base 五天
71mer以上 PAGE级 2 OD以上 12 元/Base 五天
高纯度级 0.5 OD以上 20 元/Base 五天

* 小于10mer的DNA合成按10mer计算。

  • 修饰DNA的合成价格:

修饰种类 纯化方式 合成数量 价格 交货期
dl 高纯度级 2 OD以上 200 元/处 四天
3'dl 高纯度级 2 OD以上 1,500 元/处 四天
dU 高纯度级 2 OD以上 350 元/处 四天
3'dU 高纯度级 2 OD以上 1,500 元/处 四天
S代 高纯度级 5 OD以上 15 元/处 四天
S代 普通级 10 OD以上 15 元/处 四天
dCMe 高纯度级 2 OD以上 1,200 元/处 四天

  • 标记DNA的合成价格。
    1) 5'标记DNA的合成价格:

标记种类

纯化方式 合成数量

价格

交货期
5'NH2(C6) 高纯度级 2 OD以上 300 元 五天
5'NH2(C12) 高纯度级 2 OD以上 450 元 五天
5'P 高纯度级 2 OD以上 300 元 五天
5'Dig 高纯度级 1 OD以上 750 元 七天
5'FITC(FAM) 高纯度级 2 OD以上 400 元 七天
5'Biotin 高纯度级 2 OD以上 400 元 七天
5'TET 高纯度级 2 OD以上 580 元 七天
5'HEX 高纯度级 2 OD以上 580 元 七天
5'SH 高纯度级 2 OD以上 1,500 元 七天
5'CY3 高纯度级 1 OD以上 900 元 七天
5'CY5 高纯度级 1 OD以上 900 元 七天
5'TAMRA 高纯度级 2 OD以上 600 元 七天
5'JOE 高纯度级 1 OD以上 500 元 七天
5'AMAC 高纯度级 1 OD以上 800 元 七天
5'Pyrene 高纯度级 1 OD以上 600 元 七天
5'DEA 高纯度级 1 OD以上 600 元 七天
5'NAP 高纯度级 1 OD以上 600 元 七天
5'BODIPY 高纯度级 1 OD以上 900 元 七天
5'Texas Red 高纯度级 1 OD以上 700 元 七天
5'Rhodamine (ROX) 高纯度级 2 OD以上 400 元 七天
5'Rhodamine Green (R6107) 高纯度级 1 OD以上 1,500 元 七天
5'Green 488(O-6147) 高纯度级 1 OD以上 1,200 元 七天

2) 3'标记DNA的合成价格:

标记种类

纯化方式 合成数量

价格

交货期
3'NH2(C3) 高纯度级 2 OD以上 500 元 五天
3'NH2(C6) 高纯度级 2 OD以上 500 元 五天
3'P 高纯度级 2 OD以上 380 元 五天
3'Dig 高纯度级 1 OD以上 1,400 元 七天
3'FITC(FAM) 高纯度级 2 OD以上 800 元 七天
3'Biotin 高纯度级 2 OD以上 600 元 七天
3'SH 高纯度级 2 OD以上 900 元 七天
3'CY3 高纯度级 1 OD以上 1,100 元 七天
3'CY5 高纯度级 1 OD以上 1,100 元 七天
3'Rhodamine (ROX) 高纯度级 2 OD以上 800 元 七天
3'TAMRA 高纯度级 2 OD以上 800 元 七天
3'AMAC 高纯度级 1 OD以上 1,300 元 七天
3'Pyrene 高纯度级 1 OD以上 1,000 元 七天
3'DEA 高纯度级 1 OD以上 1,000 元 七天
3'NAP 高纯度级 1 OD以上 1,000 元 七天
3'BODIPY 高纯度级 1 OD以上 1,400 元 七天
3'Texas Red 高纯度级 1 OD以上 1,000 元 七天
3'Rhodamine Green (R6107) 高纯度级 1 OD以上 2,000 元 七天
3'Green 488(O-6147) 高纯度级 1 OD以上 2,000 元 七天

3) 中间标记DNA的合成价格:

标记种类

纯化方式 合成数量

价格

交货期
NH2 高纯度级 2 OD以上 2,000 元 七天
FITC(FAM) 高纯度级 1 OD以上  2,100 元 七天
Biotin 高纯度级 1 OD以上 3,000 元 七天
CY3 高纯度级 1 OD以上 3,000 元 七天
CY5 高纯度级 1 OD以上 3,000 元 七天
Dig 高纯度级 1 OD以上 3,000 元 七天
Texas Red 高纯度级 1 OD以上 2,600 元 七天
BODIPY 高纯度级 1 OD以上 3,000 元 七天

4) 两处标记DNA的合成价格:

标记种类

纯化方式 合成数量

价格

交货期
5'FAM  3'TAMRA 高纯度级 1 OD以上 1,200 元 七天
5'TET  3'TAMRA 高纯度级 1 OD以上 1,500 元 七天
5'HEX  3'TAMRA