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3． siRNA Design Support System的使用方法

1. 进入【siRNA的设计】
2. 输入设计信息
3. 确认输入信息
4. 筛选候补序列、通过BLAST确认特异性
5. 候补序列的显示与选择（见整体图例）
6. 候补序列的显示与选择
7. 有关候补序列的选择说明
8. 问答
   

输入生物种、靶基因序列以及其它各种参数。点击各条目的带有下划线部分可以查看该条目的详细说明。点击右上部的【help】，除可以查阅各条目的详细说明外，还可以阅览siRNA设计的详细说明。

① Organism：选择靶基因的生物种。设计程序将会在所选择的生物种的Database里检索各候补siRNA序列的同源性，确认各候补序列的特异性。
② Target mRNA Nucleotide Sequence：Gene ID、Accession no.（登录在NCBI GenBank上的ID）、Your Sequence（靶基因序列的50-40000个碱基）的三项中任选一项进行输入。如果选择输入Gene ID或者Accession no.时，设计程序将会自动从GenBank的登录信息库中获得CDS信息。有关基因序列的信息将会在下一个画面中显示，请注意确认。

③ CDS start/end: 如果在②项中输入的是Gene ID或Accession no.，通常没有必要输入CDS start/end。如果在该项中输入的是Your Sequence（碱基序列），或者输入的Gene ID或Accession no.所对应的基因在信息库中没有登录CDS信息时，需要在这一项中指定CDS的start/end位置，输入开始和结束的碱基编号。在这一项中输入的start/end数字编号，将比GenBank中的CDS信息优先处理。
不输入CDS start/end时，如果指定了Gene ID或Accession no.，设计程序将根据GenBank中的CDS信息进行设计；如果输入了Your Sequence（碱基序列），设计程序将对全长序列（从第一个碱基至最后一个碱基）进行搜索设计。
④ Start with：在这一项中选择候补序列的起始碱基是以"AA"开始，还是以"NA"（N为任意碱基）开始。不选择时，自动选择"AA"。
⑤ Region：指定设计范围。通常选择"CDS"或CDS+3'UTR。
⑥ 点击【Create siRNA】按钮。如果输入了Gene ID或Accession no.时, 将会进一步确认输入的信息；如果直接输入了碱基序列时，将开始设计。

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这个画面是用来确认输入了Gene ID或Accession no.时的靶基因信息及其它设定的输入信息的。

1. 确认显示的靶基因的信息后，点击【Create siRNA】按钮，设计开始。
2. 如果没有显示靶基因的信息，或是出现了错误提示，有可能是Gene ID或Accession no. 不正确，或者是因为靶基因含有其他特殊信息等。此时请点击【Go to NCBI】按钮，画面会自动链接至NCBI Database。
   在NCBI中再次输入Gene ID或Accesion no.后，如果NCBI网页显示"No items found"时，说明Gene ID或Accession no.不正确。此时请返回siRNA Design Support System的设计页面（Design Page），输入正确的Gene ID或Accession no.后，重新进行设计。
   如果NCBI网页显示了序列，请确认CDS信息。
   如果没有CDS信息，或者存在多种CDS信息时，则本设计程序无法设计。请点击【Return to Design Page】返回前一页，输入CDS start/end项后，重新进行设计。

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① 这部分为靶基因的相关信息。
② 这部分显示靶基因和各siRNA候补序列的整体位置关系。候补序列（显示的横线）根据Score的大小用不同的颜色上下分层表示。靶基因的CDS领域通过变换颜色和其它部分进行区别。如果靶基因序列是登录在NCBI Refseq上的人的基因，并且登录有Transcript variant和SNP信息时，同时可以显示variant基因和SNP等信息。点击目标画面部分，可以显示点击部分的扩大画面。

【候补序列显示与选择整体图】

③ 这是②项"目标区域"的扩大画面。把鼠标箭头靠近至各siRNA的候补序列时，会显示该序列的各种详细信息。同时可以查阅各候补序列的BLAST结果，向「选择序列一览表」（Cart）中添加选择的候补序列（Add to Cart）等。
④ 在③的画面上选择的「选择序列一览表」（Cart）。
Make Nega按钮：点击【Make】，可通过随机的方法设计负对照siRNA序列。

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在这里点击画面时，显示画面左端会转换至点击位置。
点击【BLAST Filtering Off】，画面会显示出没有经过BLAST同源检索的所有siRNA的候补序列。
点击【BLAST Filtering On】，画面将重新回到显示BLAST同源检索后的候补序列的显示状态。

1. 原则上应根据Score的高低顺序进行候补序列的选择。
   表示有SNP的候补序列，并不就是说在所有的实验材料中的这一基因上都会有SNP的出现，只是说明有SNP存在的可能性。为了保证实验的有效进行，我们还是应该尽量避免选择使用显示SNP的候补序列。
   显示Transcript variant时，各种实验材料中的variant会各有差异，可以根据各自的实验需要，选择保守区域或者非保守区域来设计候补序列。
2. 候补序列极少，没有足够的选择余地时，请点击「Return to Design top」，返回至起始画面，然后降低设计条件（如：扩大region范围、start with改为NA等）后，重新进行设计。如果此时显示的候补序列还是极少，可以点击【BLAST Filtering Off】按钮，看一下BLAST同源筛选处理前的候补序列情况，然后选择适当的候补序列，确认其BLAST的结果。如果发现BLAST筛选时，其比较对象是靶基因的自身序列，或者与比较对象的同源性在17个碱基以下时，此候补序列可能可以使用。

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